多重分离-光谱法测定饲料中尿素含量

吴豫鄂

(武汉工程大学分析测试中心,湖北 武汉 430074)

0 引 言

饲料中添加适量的尿素可以补充动物生长所需的氮，降低饲养成本，然而过量会导致动物死亡[1].饲料中过量添加尿素对畜牧业的危害是不容忽视的，对饲料中尿素含量进行监控很有必要，但目前我国尚无相应的检测方法标准.因此，探索饲料中尿素的定量检测方法具有重要的应用价值.

尿素的测定方法有多种，但由于基体物质的干扰都不能直接用于饲料中尿素含量的测定.本研究采用吸附、沉淀与共沉淀的多重分离法对干扰物质与尿素进行分离，通过优化分离条件使分离率达到90%以上.用对二甲氨基苯甲醛光度法对分离样液中的尿素进行定量测定[2- 3]，准确地检测出了饲料中尿素的含量.

1 实验部分

1．1 仪器

德国天平METTLFTR TOLEDO AB104-S/FACT；美国惠普紫外可见分光光度计HP-8452A；德国超纯水系统Sartorius stedim arium®611UV；上海电热恒温箱DHG-9070A.

1．2 试剂

尿素标准溶液；对二甲氨基苯甲醛(DMAB)溶液；磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)；亚铁氰化钾溶液；乙酸锌溶液；活性碳；市售饲料.

1．3 实验方法

1．3．1 干扰物质的分离 称取预先粉碎至筛分0.85 mm以下的样品1～2 g(精确到0.1 mg)至100 mL小烧杯中，加入1 g活性碳，加水25 mL，迅速加入5 mL乙酸锌溶液，搅拌2 min，再加入5 mL亚铁氰化钾溶液，搅拌5 min，用质量分数3%的乙酸将pH值调到5左右，40～50 ℃保温放置2 h.用定量滤纸过滤，水洗，洗滤液承接于100 mL容量瓶中，定容.同时做试剂空白试验.

1．3．2 标准曲线的绘制 分别取1 mg·mL-1或0.2 mg·mL-1的尿素标准溶液(视样品中尿素含量而定)0、1、2、3、4、5 mL于25 mL具塞比色管中，加入5 mL磷酸盐缓冲液，加水至约15 mL，加入5 mL DMAB显色液，用水稀释至刻度，摇匀，15～35 ℃放置20 min，在420 nm波长下，用1 cm或3 cm比色池测定，以吸光度为纵坐标，尿素含量为横坐标作曲线图.

1.3.3 尿素含量的测定 取样品滤液5～15 mL加入25 mL具塞比色管中，其他步骤同1.3.2，查标准曲线计算尿素含量.

2 结果与讨论

2．1 乙酸锌、亚铁氰化钾对有机干扰物的分离效果

本研究用乙酸锌作沉淀剂分离样品溶液中的蛋白质、多肽、氨基酸[4]；用亚铁氰化钾与过量的乙酸锌反应生成胶性氰亚铁酸锌沉淀[5]，此胶性沉淀既可去除过量的乙酸锌，又有共沉淀蛋白质、多肽、氨基酸络合物的作用，还能吸附沉淀微粒使滤液澄清透明.分离效果见图1.

图1 分离效果比较图

图1是不含尿素的饲料样品经不同处理所得滤液的紫外-可见光谱扫描图.a是饲料水溶液滤液的扫描图，b是饲料经活性碳处理后滤液的扫描图，c是饲料经活性碳、乙酸锌和亚铁氰化钾处理后滤液的扫描图.a处理得到的滤液有较深的黄色，在210～420 nm之间有很强的吸收,说明其中含有丰富的有机物.b处理得到无色略带混浊的滤液，在420 nm的吸收接近于零，在300 nm附近有很强的吸收，加入DMAB后在420 nm处的吸收显著高于试剂空白.说明此处理对色素的分离效果很好，分离蛋白质、多肽、氨基酸等物质的效果较差.c处理得到无色透明的滤液，在420 nm的吸收接近于零, 在300 nm附近有微弱的吸收，加入DMAB后在420 nm处的吸收与试剂空白无明显差异.说明该处理对色素、蛋白质、多肽、氨基酸等有机物质有很好的分离效果.

2．2 活性碳的脱色效果及使用粒度、使用量的选择

活性碳是良好的吸附剂，对非极性和弱极性有机物有较强吸附力，脱色效果很好[6]，见图1.活性炭颗粒的大小，对测定结果有影响.粒度大，与溶液中的色素分子的接触的表面积相对较小，吸附效果欠佳；粒度小，过滤时间较长；当粒径过小时，会发生活性炭微粒的穿滤，穿滤的微粒在420 nm有吸收，对光度分析产生干扰，所以选用0.25～0.15 mm粒径的活性炭.

从理论上讲，随着活性炭用量增加脱色效果会增强，但是活性炭的用量过大会造成洗滤困难，在对洗滤体积有一定要求的情况下，样品中的尿素不能被完全洗出，导致测定结果偏低.经实验，称取2 g样品加入1 g活性炭能得到满意的效果.

2．3 温度对吸附分离色素的影响

温度对吸附效果有显著影响[7].

用色值测定计算吸附分离色素的效果(脱色率)：以去离子水为背景，420 nm下，1 cm的比色杯测定吸光度.

按1.3.1方法，在不同温度下制取样品脱色液，测定滤液的色值并转换成脱色率.温度对脱色效果的影响见图2.

由图2可见，脱色率与温度成正相关，超过50 ℃变化趋缓.考虑到40～50 ℃时的脱色率已满足实验要求，且温度过高会使尿素水解，选择40～50 ℃为最佳温度.

图2 温度对脱色效果的影响

2．4 时间对分离效果的影响

吸附反应达到平衡需要时间，沉淀与共沉淀完成生成、陈化、沉降的过程也需要时间，时间对分离效果有较大的影响[7].实验表明，随着时间的延长脱色效果显著变好，但2 h以后变化趋缓，选择2 h的分离时间既能取得良好的分离效果，又能相对提高分离效率，见图3.

图3 时间对脱色效果的影响

2．5 pH值对吸附分离色素的影响

用1.3.1方法制备6份实验样品，将其调节到不同的pH值，测定滤液的色值并转换成脱色率.实验表明，脱色率随着pH增大而降低，pH4～5时脱色率达90%以上，能满足实验要求，见图4.选择pH4～5为最佳酸度.

图4 pH值对脱色效果的影响

2．6 其它非蛋白含氮物质对测定干扰的研究

除尿素以外，硫酸铵、三聚氰胺、缩二脲也可能被加入到饲料中充作氮源.实验表明，这些物质不与DMAB发生显色反应，对测定尿素不产生干扰，见图5.

图5 几种物质与DMAB显色后的紫光可见光谱图

图5是硫酸铵、三聚氰胺、缩二脲等加入DMAB显色后的紫外-可见光谱扫描图.曲线B是5 mL DMAB显色剂的试剂空白扫描图；曲线V1是200 μɡ·mL-1硫酸铵加入5 mL DMAB显色后的扫描图；曲线E1是200 μɡ·mL-1缩二脲加入5 mL DMAB显色后的扫描图；曲线F1是200 μɡ·mL-1三聚氰胺加入5 mL DMAB显色后的扫描图；曲线I1是200 μɡ·mL-1尿素加入5 mL DMAB显色后的扫描图.由图5可见，420～470 nm处硫酸铵、缩二脲、三聚氰胺与DMAB试剂空白的吸收图形没有区别，而尿素在此处有明显的吸收.在420 nm处，DMAB试剂空白、硫酸铵、缩二脲、三聚氰胺、尿素加入DMAB显色后的吸光度分别是0.343，0.345，0.350，0.355，0.853，扣除试剂空白后硫酸铵、缩二脲、三聚氰胺没有吸收，尿素有0.51吸光度的吸收.

2．7 适合测定的含量范围

对二甲氨基苯甲醛光度法测定尿素线性相关性好，灵敏度不高.实验的回归曲线为y=0.112 9x+0.001 1,相关系数r=0.999 8，40 μg·mL-1尿素的吸光度为0.113.考虑到称样量和分取体积等因素，建议本法适用于尿素质量分数在0.2%以上的饲料产品.

2．8 实验中须注意的问题

饲料原材料豆粕中含有尿素酶，遇水会使尿素分解.因此当样品加入活性碳和水后，要迅速加入乙酸锌，使尿素酶沉淀失活，以免样品中的尿素被分解.

2．9 实验结果的准确性和重复性

取100 g不含尿素的饲料，加入质量分数大于99.0%的分析纯尿素2 g，充分混均，用1.2所述方法进行重复测定.尿素的平均回收率达到99.9%，实验的重现性良好，RSD为3.0%，见表1.

表1 回收实验结果

3 结 语

用活性碳吸附色素，乙酸锌和亚铁氰化钾沉淀共沉淀蛋白质、多肽、氨基酸，此多重分离的方法可以使饲料中的尿素与复杂的基体物质得到良好的分离.样品中加入分离剂后，在pH5左右的酸性条件下，于40～50 ℃静置2 h，用水淋洗分离，分离效果能达到90%以上.用对二甲氨基苯甲醛光度法对分离后的样液中的尿素进行定量分析，回收率可达到99.9%，重复实验的RSD为3.0%.

参考文献：

[1] 戴洪余.尿素在反刍动物饲料中的应用于[J].四川奶业,2007(1):9-11.

[2] 杭州大学化学系分析化学教研室.分析化学手册第三分册[M].北京:化学工业出版社, 1983: 511.

[3] 李川江,李珂,乔澍,等.对二甲氨基苯甲醛比色法测定微量尿素的改进[J].四川师范大学学报：自然科学版,2010,33(3):410-412.

[4] 邢存章,于跃芹.有机化学[M].济南:山东大学出版社, 2001: 696.

[5] 陈寿椿.重要无机化学反应[M].上海:上海科学技术出版社, 1994: 1501.

[6] 戴卫东，钱礼华，汪守建.活性炭吸附棉籽糖液中色素的工艺研究[J].食品科技,2009,34(9):213-216.

[7] 颜肖慈,罗明道.界面化学[M].北京:化学工业出版社, 2005: 143.