辣椒细菌性疮痂病病原菌分类、检测及综合防治研究进展

陈 新, 刘清波, 赵廷昌*

(1.中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100193;2.湖南农业大学生科院生物技术系,长沙 410128)

辣椒细菌性疮痂病在世界各地都有发生[1],并且是热带和亚热带地区辣椒和番茄上的一种主要病害[2]。在国外,研究人员在病害症状与发生规律、病原菌鉴定、生理小种的分布与变异、病原菌抗药性与寄主抗性及其遗传特性、综合防治等方面进行了很多有益的研究工作[3]。国内最早在东北三省有发生记载,曾列为国内检疫对象,但相关研究较少[4]。近几年来,国内外一些研究人员在病害症状与发病规律、病原菌的鉴定与检测、生理小种的分布与变异和综合防治等方面取得了一些进展[5-6]。

1 病害症状与分布

辣椒细菌性疮痂病又称辣椒细菌性斑点病,俗称“疱病”,是辣椒和番茄上普遍发生的一种世界性分布的病害。该病害在生产上主要危害辣椒和番茄的叶片、茎蔓和果实。在辣椒上,尤以叶片发生普遍。叶片发病,初期形成水渍状、黄绿色的小斑点,扩大后变成圆形或不规则形、暗褐色、边缘隆起、中央凹陷的病斑,粗糙呈疮痂状,潮湿时病斑上有菌脓溢出;在番茄上,茎和果实的病斑往往木栓化,病斑开裂,造成疮痂。

这种病害广泛分布于湿度较大而天气暖和的世界各地区。目前,该病害在欧洲、亚洲、非洲、北美洲、南美洲以及加勒比海地区的大多数国家和地区都有发生分布[7]。20世纪40年代,土耳其、以色列、希腊、南部非洲、古巴及智利等国家和地区都把该病害作为检疫对象。然而后来该病害在这些国家中也迅速蔓延开来。国内曾将该病害作为检疫对象,而在很长一段时间内几乎没有该病害的相关研究。1991-1993年,孙福在等[5]调查发现该病害在东北、内蒙古的呼和浩特和包头、山西大同、北京郊区、新疆的石河子和阜康、山东以及云南等地的辣椒和番茄上不断发生和蔓延,造成很大损失。1992年,新疆的李春等[8]对石河子、玛纳斯等地的菌株进行了初步报道。在2007-2009年,赵廷昌等(结果未公布)调查发现该病害在江苏邳州、安徽合肥、河北保定、内蒙古通辽、北京延庆、陕西杨凌、山西朔州、新疆吉木萨尔县、山东泰安、福建福州以及黑龙江的哈尔滨和双城等地的辣椒或番茄上都有发生和分布;龙玲等[9]调查发现该病害是贵州毕节地区辣椒上的主要病害之一,并且在辣椒全生育期都产生危害。

2 病原菌

辣椒细菌性疮痂病病原菌为野油菜黄单胞杆菌辣椒斑点病致病变种[Xanthomonas campestris pv.vesicatoria(Doidge 1920)Dye 1978](下面简称 Xcv)。菌体短杆状,两端钝圆,大小为(1.0～1.5)μ m×(0.6～0.7)μ m;单极生鞭毛,能游动;菌体排列成链状,有荚膜、无芽胞;革兰氏染色阴性,好气;在YDC平板培养基上,菌落呈圆形,凸起,黄色,黏稠;在CKTM 选择性培养基上的Xcv菌落比在YDC平板培养基上的要小一些,但是黄色菌落周围有一圈清晰的菌环。病菌发育温度范围5～40℃,最适温度27～30℃,致死温度为59℃10 min[10-11]。病原菌主要在种子表面或随病残体在土壤中越冬,成为病害初侵染来源,病原细菌从气孔或水孔侵入,在叶片上潜育期为3～6 d,果实上5～6 d。据报道,在田间,只要最初有10%的植株发病,就为整块田发病提供了足够的菌量。

2.1 寄主

Dye D W等人[12-14]先后报道了辣椒(Capsicum annuum)、番茄(Lycopersicon esculentum)、曼陀罗(Daturastramonium)、天 仙 子 (Hyoscyamus spp.)、枸杞(Lycium spp.)、黄花烟草(Nicotiana rustica)、马铃薯(Solanum tuberosum)、欧白英(Solanum dulcamara)、龙葵(Solanum nigrum)、小酸浆(Physalisminima)和茄子(Solanum melongena)等都是该病原菌的寄主,其中的辣椒和番茄是其主要寄主。后来,Laub和Stall[15]报道小酸浆和龙葵不是其寄主。因此,对该病原菌寄主的研究工作还需进一步开展。

2.2 分类

1921年,Doidge在南非分离出了引起番茄疮痂病的病原菌,并将病原菌命名为Bacterium vesicatorium[16]。同年,Gardner和Kendrick在美国印第安纳州也分离到了这种病害的病原菌,并将其命名为Bacterium exitiosa[17]。美国的病原菌和南非的病原菌的一个主要区别在于前者具有很强的水解淀粉活性而后者具有很弱或没有水解淀粉活性。几乎在同一时间,Sherbakoff[18]描述了辣椒上的疮痂病。随后,Higgins[19]以及 Gardner和 Kendrick[20]先后将Bacterium vesicatorium和Bacterium exitiosa分别同辣椒疮痂病病原菌进行了多项鉴别试验并最终确认这3种病原菌是同一种菌,遵照命名优先的原则,Gardner和Kendrick建议将这种病原菌命名为Bacterium vesicatorium Doidge。1939年,Dowson将其更名为 Xanthomonas vesicatoria[21]。其后,Dye又更名为Xanthomonascampestris pv.vesicatoria[22]。

早在20世纪60年代,Dye等就已经发现辣椒疮痂病病原菌存在相当丰富的表型多样性[23],但直到20世纪90年代,Vauterin等[24-25]和Stall等[26]才各自独立研究发现：在Xanthomonascampestris pv.vesicatoria中存在两个表现型和遗传特性不同的组,即A、B组,这两个组是通过解淀粉、果胶活性测验和脉冲电场凝胶电泳分析鉴别出来的。1994年,Bouzar等[27]比较了150株从辣椒和番茄上分离到的Xcv菌,研究发现：A组菌完全没有水解淀粉、果胶活性,而B组菌具有较强地水解淀粉、果胶活性;A组菌具有一段独特的32～35 ku大小的蛋白α,而B组菌具有一段25～27 ku大小的蛋白β。Bouzar等[28]利用单克隆免疫反应以及Vauterin等[25]和Stall等[26]利用DNA-DNA杂交试验都证实了A、B两个菌组不属于同一个种。1995年Vauterin等[25]建议将Xanthomonas campestris pv.vesicatoria划分为2个不同的种,B组菌保留在Xanthomonas vesicatoria中,而将A组菌设为Xanthomonas axonopodis的一个致病变种Xanthomonas axonopodis pv.vesicatoria。

1957年,Sutic[29]在南斯拉夫分离到了番茄上的一种新的病原菌,并将其命名为Pseudomonas gardneri。1966年,Dye[30]将Sutic鉴定的 P.gardneri同其他一些黄单胞菌作了标准测验,结果发现P.gardneri和X.vesicatoria是同一种菌。在20世纪90年代,Bouzar等[31]就已经利用Rep-PCR技术在哥斯达黎加发现了这种病原菌,而Jones等[32]也研究证实了这2种菌属于同一个种。另外,Jones等[33]在美国佛罗里达州分离到番茄上的T3小种,经血清学和脉冲电场凝胶电泳分析,该菌与上述各菌都不同[32,34]。根据病原菌对碳基质的利用、酶活性、血清学(单克隆抗体反应)、脉冲电场凝胶电泳得到的限制性片段长度多态性结果,Jones等[32]将上述两种病原菌归为Xanthomonas campestris pv.vesicatoria的两个不同菌组,即C和D。T3是C组菌的典型菌株。由于C组菌和A组菌的DNA一致性很高,而将C组菌设为Xanthomonas axonopodis pv.vesicatoria。D组菌在遗传特性上与其他3个菌组没有共同点,Sutic所鉴定的P.gardneri是D组菌的典型菌株,但P.gardneri的分类地位还很模糊。以Dye[30]的试验为基础,经过脂肪酸组成分析和病原菌对碳基质的利用测验[28],清楚地发现Sutic所鉴定的病原菌是一种黄单胞菌。而且,Jones等[32]通过 16S rRNA序列分析证实了这种病原菌与其他3个菌组在系统发育方面关系紧密。

最早由Gardner和Kendrick在美国印第安纳州鉴定的菌可能就是世界性分布的B组菌,即X.vesicatoria,而Bouzar等[27]所描述的世界性分布的A组菌与Doidge[16]所描述的菌是一样的,即 X.vesicatoria,为避免异物同名的混乱,Jones等[35]于2004年将 A、B、C、D这 4个表型组命名为4个种：X.euvesicatoria(A 组)、X.vesicatoria(B 组)、X.perf orans(C组)和X.gardneri(D组)。A组包括Doidge描述的所有菌系,B组包括Gardner和Kendrick描述的所有菌系。C组菌是在20世纪90年代从美国佛罗里达州分离得到的。D组菌是1957年Sutic在南斯拉夫分离得到的,后来在哥斯达黎加和巴西也有报道。

A、B、C、D 4个菌组的比较见表1。

表1 4个表型组的分类比较

后来,Jones等[35]检测了 A、B、C、D 4个菌组的DNA同源性,发现A组菌和C组菌的DNA一致性高达40%,但A组菌与C组菌、Xanthomonasaxonopodis pv.axonopodis的典型菌株之间的DNA一致性远低于同种DNA之间的一致性水平(≧70%,根据Wayne等[36]);另外,B、D两个菌组之间的DNA一致性不到10%,与A或C菌组之间的DNA一致性也不到10%。

2.3 生理小种划分和分布

1969年,佛罗里达州的Cook和Stan根据该病原菌在番茄上感病性及辣椒上过敏性反应的差异,首先提出了小种划分的依据(根据病原菌在辣椒或番茄上的毒性),并依此把佛罗里达的Xcv菌分成3个生理小种[37]。随后,他鉴定了一些品种的抗病性,并提出了一套初步的鉴别寄主,这套鉴别寄主目前已发展为辣椒生理小种的5种鉴别寄主,它们分别是‘Early Calwonder'(ECW)、‘ECW-10R'(含有抗性基因Bs1)、‘ECW-20R'(含有抗性基因Bs2)、‘ECW-30R'(含有抗性基因Bs 3)和Capsicum pubescens品种‘PI235047'(含有抗性基因Bs4)[38-39]。目前,国际上共发现了辣椒上的11个生理小种(P0～P10),详见表2[35]。

表2 不同生理小种对辣椒不同栽培品种和不同抗病基因的反应

辣椒上的生理小种是根据它们在ECW及其近等基因品系‘ECW-10R'、‘ECW-20R'和‘ECW-30R'以及 Capsicum pubescens品种‘PI235047'上是否引起过敏性反应来鉴别的。ECW对目前发现的11个小种都感病;ECW-10R(含有抗性基因Bs1)对小种P0、P2和P5具有抗性;ECW-20R(含有抗性基因 Bs 2)对小种 P0、P1、P2、P3、P7 和 P8具有抗性;ECW-30R(含有抗性基因Bs3)对小种 P0、P1、P4、P7和P9具有抗性;‘PI235047'(含有抗性基因Bs4)对小种 P0、P1、P3、P4 和P6 具有抗性,而小种P10是小种P6的变异株,它对寄主‘PI235047'不具有抗性[39]。小种P1、P2早在1969年在美国就有报道,在1972年巴西也报道了这两个小种。20世纪80年代,Cook和Stall调查研究了世界各地辣椒上的生理小种,结果发现P1在世界各地都有分布,而P2仅在美国佛罗里达州和瓜德罗普岛(法)有分布。P0最早发现于北卡罗来纳州,随后发现在墨西哥、巴西、巴巴多斯和美国俄克拉荷马州都有分布。P3在美国俄亥俄州、佛罗里达州和加勒比海等地都有分布。P4首先发现于澳大利亚[40],后来在美国东南部、巴巴多斯发现也有分布。P5、P6在美国有分布,P7、P8在美国俄亥俄州有分布。

在国内,1992-1993年,孙福在等[41]对采自北京、山西、内蒙古、云南和新疆等地的 19个株系,用标准鉴别寄主进行了鉴定。结果表明：我国存在2个小种,即番茄小种 1(T1)和辣椒、番茄小种 3(PT3)。前者只存在北京地区,后者为我国优势生理小种,遍布我国大部分辣椒、番茄产区。

分子生物学被用于病原菌分类的同时也被用来鉴别不同小种。Obradovic等[42]根据hrp基因在4个表型组中的保守序列设计引物,采用REA-PCR方法,先将PCR产物用不同的限制性内切酶(CfoⅠ、TaqⅠ和HaeⅢ)进行酶切,再通过凝胶电泳分析差异,从而将疮痂病病原菌的4个组以及小种区分开来,同时也与其他细菌性病害病原菌分开,本实验室的陈新等(结果未公布)已经利用这种方法对采自国内新疆、山西、北京、内蒙古等地的85个菌株进行了研究,结果发现上述4种表型菌系在85个菌株中都有存在。

2.4 病原菌的检测

对Xcv菌的检测鉴定方法大致可分为两大类：第一大类包括利用半选择性培养基分离培养[43-45]、生化测验[46]、血清学测验[47-49]、脂肪酸分析和代谢类型分析[50-52];第二大类是以病原菌基因组DNA为基础的一类方法,按照是否与PCR扩增技术组合使用可将方法分为两类[53],即基于PCR的基因组指纹图谱方法(如：rDNA-PCR、ITS-PCR、tRNAPCR、rep-PCR、AFLP-PCR、AP-PCR 等 等)和DNA-DNA同源性分析。第一大类方法较第二大类方法,检测所需时间更长,灵敏性和特异性都不及后者。

Kuflu和Cuppels[54]从 Xcv菌株 DC93-1的基因组中获得了一段功能未知的序列 KK1750(1.8 kb),并利用它制备Southern杂交的探针来检测病样中的Xcv菌,如果结合半选择性培养基CKTM[45]分离培养病原物,检测效果会更好,但是完成Southern杂交需要四五天。

Leite等[55-56]利用Xcv菌hrp基因保守序列所设计的引物来扩增待测病原菌的hrp相关序列,并用几种特异的限制性内切酶对扩增产物进行酶切,再经琼脂糖凝胶电泳进行分析,可用于辣椒或番茄的种子带菌检测,检测最低浓度是种子洗液中含菌102～103cfu/mL,其灵敏性大概是常规ELISA的1 000倍。后来,Obradovic等[42]所用的方法与其类似,只是重新设计了一对引物而已。

Van Doorn等[57]根据Xcv菌中序列 f imA设计了一对特异性引物,但只能检测出B组菌(X.vesicatoria)。

Cuppels等[58]对从加拿大安大略省一些番茄种植区分离到的Xcv菌进行了检测、鉴定等相关研究,研究发现他们所设计的引物对BSX1/2能够检测出大多数的供试菌株,并且灵敏度达到每个反应30～50 cfu。

rhs基因家族存在于大肠杆菌K-12中,具有高度的序列保守性,已被完全测序[59]。Park等[60]研究发现rhs基因序列在致病变种水平具有差异性,并利用Xcv菌的rhs基因序列设计了致病变种水平的特异性引物,对红辣椒叶片中的Xcv菌进行检测,获得了很好的灵敏度和特异性。

3 抗性鉴定

寻找抗性材料、遗传研究和抗性育种等都是在抗性鉴定的基础上完成的。对辣椒细菌性疮痂病的抗性鉴定是通过渗入法评估过敏性反应的进展、将幼苗浸在带有表面活性剂的菌悬液中来评估病原菌的寄生和生长情况以及喷雾接种以建立田间病害流行条件而完成的,但最可靠的方法还是在田间进行喷雾接种鉴定[6]。将在YDC琼脂培养基或King's medium B(KB)培养基上30℃下培养了24～48 h的Xcv菌株悬浮于0.01 mol/L的硫酸镁(pH7.2)中制成108cfu/mL(A660=0.06)的菌悬液,接种前后均需要保持较高的湿度和温度。

蒲金基等[61]在对18个海南反季节辣椒栽培品种的田间发病调查中发现,只有海南黄帝椒对细菌性疮痂病表现免疫,12个品种表现中抗,其余均表现感病或高感。本实验室的孙福在等[62]利用我国优势小种菌株XV14和XV19[41]的混合悬浮液接种64份辣椒或甜椒品种,最后获得了5份高抗材料。近期,赵廷昌等(结果未公布)同样利用XV14和XV19的混合悬浮液对全国 120份辣椒或甜椒品种进行了抗性鉴定,结果发现了12份高抗材料。

4 综合防治

到目前为止,还未发现对辣椒或番茄上的所有细菌性疮痂病菌都具有抗性的商业品种。因此,选用不带菌的种子、实行作物轮作、加强田间卫生管理、实施精确灌溉、一些杀细菌剂(如：铜制杀菌剂、苯并噻二唑等)和一些杀真菌剂(如：百菌清、代森锰锌等)组合使用等等是目前防治该病害所广泛采用的措施。

4.1 化学防治

龙玲等[63]对贵州毕节地区大方县辣椒疮痂病发生规律进行了调查并对化学防治进行了研究,结果发现,辣椒疮痂病在当地发病期一般在5月上旬,危害盛期在6月中旬至7月中旬,7月下旬老病叶大量脱落,新病叶增加缓慢,病情不再发展,另外,在发病初期用77%氢氧化铜可湿性粉剂或72%农用链霉素可溶性粉剂连续防治2次,可取得较好防效。

4.2 栽培防治

从无病株或无病果上选留生产用种。种子带菌可采用55℃温水浸种10 min或在1∶10的农用链霉素中浸种30 min或用0.1%的高锰酸钾溶液浸种15 min,清水清洗后催芽播种。也可冷水浸种10～12 h,再用1%硫酸铜溶液浸种5 min,捞出后用少量草木灰或生石灰中和酸性,即可播种。

Pohronezny等[64]研究发现秋播比春播能减轻病害发生、下午播种比上午播种发病要轻,而在播种操作前用乙醇或聚乙烯吡酮磺洗手也能在一定程度上减轻该病害的发生。

4.3 生物防治

Kousik等[65]研究了携带有不同组合抗性基因的鉴别寄主对生理小种的抗性情况,发现有些组合能够大大减轻病害的发生。

苯并噻二唑是一种植物激活剂,Louw s等[66]研究发现,这种物质能诱导番茄在受到Xcv菌侵染时产生系统获得性抗性。

Abbasi等[67]将木质素磺酸铵和磷酸钾按一定比例配制的混合液喷洒到番茄和辣椒叶片上,发现这种方法同使用杀菌剂相比,防治效果要好得多,并且能够提高番茄或辣椒的上市产量。

利用病原菌特异的噬菌体防治该病害是一种很好的方法,但是由于噬菌体在作物叶片上的存活期较短[68],使得防治效果大打折扣。Balogh等[69]研究发现,通过添加一些辅佐剂,能够提高噬菌体在叶片上的存活期,从而提高了防治效果。

据报道,许多叶部病原细菌在侵染之前就定殖在叶表面,并且其群落密度与引起的病害严重性和发病率成正相关。Alexei[70]等设想利用番茄叶片上营养需求与Xcv菌相似的非致病菌来减轻番茄上细菌性疮痂病的严重程度,但结果发现：番茄叶片上的营养需求与Xcv菌相似的非致病菌与Xcv菌的营养需求相似程度对于减小番茄叶片上Xcv菌的群落密度无作为,也就不能减轻病害;叶表面的Xcv菌群落密度与引起病害的严重程度无关。

El-Hendawy等[71]用水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)处理番茄叶、根、土壤后取得了对 Xcv菌很好的防治效果,如果在播种前用这种菌处理种子将会得到更好的预防效果。

Moss等[72]利用Xcv75-3菌hrp基因簇中的相关基因突变体对番茄细菌性疮痂病的防治效果进行了研究,发现将突变体75-3ShrpG喷施到番茄叶片上对该病害具有很好的防治效果。

综合利用生防菌、促进植物生长的根际细菌、系统获得性抗性诱导因子(如：过敏性抗病性蛋白、苯并噻二唑等)以及Xcv菌的特异性噬菌体等[73-75]防治方法将成为防控该病害的主流趋势。

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