肝外胆管癌CD44v6、MMP-2的表达及意义

朱林生 王勇 常桂芝

CD44(Cluster of differentiation，CD)是一种分布极为广泛的表面跨膜糖蛋白，是一种表面粘附分子，主要参与细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的特异性黏附过程。广泛存在于白细胞、上皮细胞及内皮细胞上，属于黏附分子中选择素家族的一员。人类CD44基因位于11号染色体短臂上，CD44分子具有广泛的生物学功能，包括介导多种细胞与细胞外基质的相互作用，介导白细胞与活化的内皮细胞结合参与炎症反应，介导淋巴细胞归巢，并参与细胞伪足的形成和迁移运动。其中CD44v6因有组织的特异性，在多种肿瘤的发生、发展、浸润转移和预后中起重要作用，因此近年来备受关注。基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMPs)是一组锌离子依赖性内源性蛋白酶，根据其底物的不同，可分成胶原酶、明胶酶、溶基质素等。其中MMP-2属于明胶酶A类，分子量为72 kD，主要水解Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原、明胶及TNF-α。细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是广泛存在于细胞之间的网状结构，主要由胶原构成，其除对细胞起支持与连接作用外，还参与细胞的增殖及分化等多种生理过程。MMPs是一组ECM的重要降解酶，对ECM的稳定有重要作用。近年来大量证据表明基质金属蛋白酶，特别是MMP-2在介导肿瘤细胞的细胞外基质降解中起重要作用。MMP-2活性和表达的增加与人类多种恶性肿瘤的侵袭、转移及预后密切相关。本研究通过检测胆管癌组织、胆管良性病变组织中CD44v6及MMP-2的表达情况，揭示CD44v6及MMP-2与胆管癌分期、分化程度、淋巴结转移之间的关系，为肿瘤临床诊断、治疗及预后提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究所有肝外胆管癌标本均选自我院2008年12月至2010年5月手术切除原发性胆管癌患者45例，其中男26例，女19例，男女比例为1.39∶1;年龄47～75岁，平均年龄53.7岁;术前未接受任何抗肿瘤治疗。术后病理组织学均为腺癌。分化程度:高分化17例，中分化15例，低分化13例。TNM分期:Ⅰ，Ⅱ期共12例，Ⅲ期20例，Ⅳ期13例。有淋巴结转移28例，无淋巴结转移17例。正常对照非癌胆管组织10例，因梗阻性黄疸、胆管炎、胆总管囊肿行胆肠吻合术，术后病理证实为非癌胆管组织，胆总管囊肿6例，硬化性胰腺炎2例，胰胆管合流异常1例，十二指肠乳头炎致胆总管狭窄1例。所有标本均为手术切除新鲜标本。标本取材后由中性甲醛固定，常规石蜡包埋。每份标本连续4 μm厚切片3张，1张行常规HE染色核实诊断，2张用于免疫组织化学染色。试剂:鼠抗人CD44v6单克隆抗体购自美国Zemd公司，浓缩液0.1 ml。鼠抗人MMP-2单克隆抗体，浓缩液0.1 ml。SP试剂盒、DAB显色剂均由北京中山生物制品公司提供。

1.2 方法 CD44v6及MMP-2均用鼠抗人单克隆抗体连续4 μm厚超薄组织切片行免疫组织化学染色，染色过程中每批均设立以PBS代替相应一抗制成的阴性对照片，以除外假阳性结果。

1.3 结果判定 CD44v6及MMMP-2均为细胞浆、细胞膜表达。(1)依据细胞着色强度计分:0分:细胞无显色;1分:浅黄色;2分:棕黄色;3分:棕褐色。(2)依据阳性细胞数计分:0分:无显色癌细胞;1分:显色癌细胞占切片癌细胞总数1/3以下;2分:显色癌细胞占切片癌细胞总数的1/3～2/3;3分:显色癌细胞占切片癌细胞总数的2/3以上。400倍显微镜下每张切片记数5个视野，每个视野100个细胞。每例肿瘤积分等于以上两项之和。分为:－:0分;+(低表达):1～4分;++(高表达):＞4分。

1.4 统计学分析 采用直接概率、χ2检验及Spearman等级相关检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD44v6、MMP-2表达与临床病理特征关系 CD44v6、MMP-2表达与肿瘤TNM分期、淋巴结转移相关，阳性率差异有统计学意义(P＜0.05)。与胆管癌分化程度无关(P＞0.05)。见表 1。

表1 CD44v6、MMP-2的表达与临床病程特征关系 例

2.2 CD44v6、MMP-2在胆管癌、非癌胆管组织中的表达CD44v6、MMP-2在胆管癌、非癌胆管组织的表达差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2，图1、2。

表2 CD44v6、MMP-2在胆管癌与非胆管癌组织中的表达 例

图1 胆管癌组织中CD44v6阳性表达(10×40，++)

图2 胆管癌组织中MMP-2阳性表达(10×20，++)

3 讨论

CD44是1989年前后发现的一种细胞表面的跨膜糖蛋白。多项研究显示CD44v6的过度表达与肿瘤的侵袭、转移及不良愈后明显相关［1－4］。CD44v6参与肿瘤浸润、转移的可能机制为:(1)CD44v6与透明质酸(HA)结合，并通过HA发挥促进肿瘤转移的作用。HA可介导原发性肿瘤生长及肿瘤细胞在转移灶中生长;膜表面表达有CD44v6的肿瘤细胞与HA结合后，HA可帮助其完成免疫逃逸，延长肿瘤细胞在血循环中的时间;当肿瘤细胞表面的CD44分子与血管周围的HA结合，则肿瘤细胞可以通过受体介导的吞噬作用将HA在溶酶体中降解，使之更易进入循环而产生转移，这与吴迪等［3］的肝癌移植术中肿瘤播散组与无肿瘤播散组血清CD44v6水平差异有显著性实验结果得到了相互印证。CD44与HA作用减弱使肿瘤细胞更易于脱离原发灶，进入淋巴或血液循环，CD44与HA相互作用的增强，使肿瘤细胞易于附着于异地形成转移灶。(2)使肿瘤细胞获得与活化的淋巴细胞相类似的生物学特点。活化的T、B淋巴细胞均表达CD44v6，活化的淋巴细胞与肿瘤细胞具有许多相类似的生物学特点，如黏附、迁移、外渗及浸润等。这些相似性可能基于完全相同或相似的分子特性。CD44v6可使肿瘤细胞获得与活化的淋巴细胞相类似的生物学特性，模仿淋巴细胞归巢过程，参与肿瘤细胞淋巴结转移。(3)影响细胞内骨架蛋白的构象和分布，改变肿瘤细胞的运动能力。李祖国等［5］观察了CD44v6对结肠癌细胞骨架的影响，发现CD44v6单克隆抗体封闭前后结肠癌细胞内肌动蛋白的构象和分布明显不同，认为CD44v6可能通过细胞内羟基端结构影响细胞内骨架蛋白的构象和分布，从而改变肿瘤细胞的运动能力参与肿瘤转移机制。(4)研究结果显示CD44v6分子参与了新生血管的形成，从而恶性肿瘤的微血管密度(MVD)表达上调［6］。(5)参与信号转导功能，CD44v6可催化Met及其配体复合物的形成，抗CD44v6抗体可阻断Met的活化［7］。已知受体酪氨酸激酶的胞浆结构域是细胞内信号转导网络中各种成分的停泊点。缺乏激酶结构域的受体常需与受体酪氨酸激酶协同作用，或通过调控激酶的活性而介导细胞的信号转导。CD44黏附分子则具有这种协同受体作用CD44参与信号转导中跨膜复合体的组装［8］，在细胞增殖与停滞间充当分子开关的角色，当CD44胞浆结构域尾部与磷酸化的ERM蛋白结合时促进细胞增殖，而与脱磷酸化的Merlin蛋白结合时则阻断Ras→Raf→MEK→ERK的信号转导使细胞生长停滞。

MMPs是一组锌离子依赖的内源性蛋白酶，根据其底物的不同可分为胶原酶、明胶酶及溶基质酶素等。MMP-2属于明胶酶A。MMPs的抑制剂称为组织基质金属蛋白酶抑制剂。MMP-2的表达上调及MMP-2/TIMMP-2比例失衡被认为与恶性肿瘤的浸润转移有关［9－11］。MMP-2的主要水解底物为Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原、明胶及TNFα。细胞外基质(extracellular matrix，ECM)主要由Ⅳ型胶原及层粘连蛋白(LN)等构成。MMP-2可以降解细胞外基质，在正常稳定状态组织中MMP表达量极少，而在细胞转化过程中表达量上升。体外实验结果显示MMP-2在介导肿瘤细胞的细胞外基质降解过程中起主要作用，转染S100A4基因上调MMP-2表达使胰腺癌细胞具有高侵袭性，MMP-2表达下调胰腺癌细胞体外迁移和侵袭能力显著降低［10，12］。实验结果表明随着MMP-2表达增强，进入循环的肿瘤细胞也增多［13］。MMP-2在肿瘤新生血管形成中也起重要作用。MMP-2可诱导血管新生亦被基因敲除的动物模型所证实［14］。

因此我们可联合检测术后胆管癌组织中CD44v6及MMP-2的表达作为预后指标，同时我们应以CD44v6及MMP-2为切入点对其进行精细调节，开辟胆管癌治疗新领域。

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