混合菌发酵稻草室温条件的研究

李明轩 耿春银 张 敏

农作物秸秆是最丰富的木质纤维素资源[1]，稻草作为我国产量最多的秸秆饲料，消化蛋白质含量低，粗纤维含量较高，很大一部分的纤维素不能被畜禽类胃肠道消化分解，要靠体外的强酸、强碱以及特定的微生物来分解，以至于营养价值很低[2]。稻草资源在我国具有分布广，产量大，价格低廉的特点，但是利用率很低。这是因为稻草主要由纤维素、半纤维和木质素组成，其木质素含量很低，但它紧紧的包裹在纤维素的表面，并且与纤维素、半纤维素有着较牢固的化学连接,这样就使秸秆的利用率大大降低[3]。本试验就是利用白腐菌先降解纤维素外围的木质素，更有利于康氏木霉对纤维素的降解，试验采用康氏木霉、白腐菌、酵母菌混合培养发酵稻草，提高了稻草利用率及其营养价值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

康氏木霉(Trichodrma pseudokoning)由延边大学农学院动物营养实验室提供；

白腐菌 5.132（Fomes lignosus）购于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心；

酵母菌（Yeast Bacteria）由延边大学农学院动物营养实验室提供。

1.1.2 培养基

CPDA培养基：马铃薯浸提液1 ml；葡萄糖20 g、KH2PO43.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、维生素 B1微量、琼脂15 g，pH 值 6.0；

PDA培养基：去皮马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂15 g，水 1000 ml，121 ℃高压蒸汽灭菌 30 min。

固体发酵培养基：稻草6 g、麸皮4 g，自然pH值，营养液6 ml；营养液构成：蔗糖22.8 g、(NH4)2SO410 g、K2HPO45 g、MgSO42.5 g、水 1000 ml。

1.1.3 主要试剂

①DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸显色液）；②1%乙酸－乙酸钠缓冲溶液（pH值为4.8）；

③1%CMC溶液：羧甲基纤维素钠（CMC）1 g以pH值4.8醋酸缓冲液定容至100 ml。

1.2 方法

1.2.1 菌种间相容性试验[4]

1.2.1.1 康氏木霉和酵母菌

酵母菌接种PDA培养基平板，再接种康氏木霉菌种于其上，另一PDA培养基平板上接康氏木霉菌种，作为对照。培养条件：28℃静置培养5 d。

1.2.1.2 白腐菌与酵母菌

酵母菌接种CPDA培养基平板，再接种白腐菌种于其上，另一CPDA培养基平板上接白腐菌菌种，作为对照。培养条件：室温下培养。

1.2.1.3 康氏木霉与白腐菌

将康氏木霉与白腐菌接入到同一PDA培养基平板上，28℃静置培养5 d，观察其生长情况，比较同一平板上两种菌种的生长情况，为下一步混合发酵做参考。

1.2.2 发酵培养基优化试验

采用正交试验来确定康氏木霉、白腐菌与酵母菌混合发酵稻草秸秆饲料的最佳培养基。采用三因素三水平正交试验方法，三水平为稻草：麸皮(A)、尿素(B，氮源%)、营养液(C,%)，正交试验因素水平见表1。发酵前后测定原料中的羟甲基纤维素酶活性、粗纤维和粗蛋白含量。

表1 L9(33)正交试验因素水平

1.2.3 发酵条件优化单因素筛选试验

1.2.3.1 发酵时间

按1 ml接种量（康氏木霉：白腐菌：酵母菌=1：1：1）接种于上述优化培养基中，在室温的条件下分别培养 5、6、7、8、9、10 d 发酵结束后分别测定发酵产物中的羧甲基纤维素酶活性、粗纤维和粗蛋白质含量。

1.2.3.2 接种量

分别按1、1.5、2、2.5和3 ml接种量（康氏木霉： 白腐菌：酵母菌=1：1：1）接种于上述优化培养基中，在室温的条件下分别培养6 d，发酵结束后分别测定发酵产物中的羧甲基纤维素酶活性、粗纤维和粗蛋白质含量。

1.2.3.3 接种比例

按1 ml接种量（康氏木霉：白腐菌：酵母菌=1：1： 1，1： 2： 2，1： 3： 3，1： 2： 1，2： 1： 2，3： 1： 3）接种于上述优化培养基中，在室温的条件下分别培养6 d，发酵结束后分别测定发酵产物中的羧甲基纤维素酶活性、粗纤维和粗蛋白质含量。

1.2.4 最佳条件下的发酵试验

在上述正交试验和单因素筛选出的最佳条件下进行混合菌种发酵稻草的试验。

1.2.5 测定指标

羧甲基纤维素酶（CMC）测定采用DNS还原糖测定法；粗纤维含量测定：采用酸-碱洗涤法(张丽英，2007)[5]；粗蛋白质含量测定：采用凯氏定氮法(张丽英，2007)[6]。

2 结果与分析

2.1 菌种兼容性试验

2.1.1 康氏木霉与酵母菌

与对照组相比，康氏木霉在酵母菌做成的平板长得好，比较旺盛，但是生长蔓延得速度较慢，充分说明了酵母菌与康氏木霉之间不存在抑制作用，与史国翠(2011)[7]报道的一致，酵母菌利用分解培养基的营养物质，分解产物促进康氏木霉的生长。

2.1.2 白腐菌与酵母菌

白腐菌在有酵母菌的平板中比对照组的菌丝更浓密，更粗更壮，但蔓延的速度相对较慢，试验表明酵母菌与白腐菌之间没有拮抗作用并且互利共生，因为酵母菌能分解利用培养基中营养物质，降解的糖和其它的营养物质，促进白腐菌的生长，即使白腐菌生长得很好，菌丝洁白，粗壮，但白腐菌的生长仍然受到限制，菌丝在平板中蔓延的很慢，可能是因为酵母菌铺满整个平板，白腐菌没有生长的空间。

2.1.3 康氏木霉与白腐菌

白腐菌的生长与康氏木霉比较相对较慢，康氏木霉先长满整个平板，说明两者之间可以兼容共生，但白腐菌丝生长多少受到一些抑制，也许因为康氏木霉生长的更快，争夺了白腐菌丝的生长空间，使它无法生长，长满整个平板需要较长的时间。

2.2 最优培养基的确定

通过三因素三水平的正交试验确定了多菌种混合发酵稻草的最优培养基，结果见表2。

三因素三水平正交试验结果极差（R）分析可以看出纤维素酶活性、粗蛋白和粗纤维优化条件一致，影响因素次序为：A>B>C，影响最大的是稻草与麸皮的比，其次是尿素的添加量，最后是营养液的添加量，从极差表中的数据综合分析可以得出，混合菌种发酵稻草的最优培养基为A2B2C2，即稻草：麸皮=6：4,尿素添加量2%，营养液添加量60%。此时，发酵获得纤维素酶活性、蛋白质都较高，粗纤维的含量最低。

2.3 发酵条件的优化单因素筛选

2.3.1 混发酵时间的确定

多菌发酵产纤维素酶和蛋白质合成都是随着发酵时间变化呈现不同的变化趋势，从图1、图2可以看出，酶活性和粗蛋白在发酵的第6 d均最高，粗纤维含量最低，此后继续发酵结果则相反。因为菌体生长阶段随着时间的不同出现稳定期和最高生长期，菌种数量越多，产酶量就越大，蛋白含量越高，纤维素酶把纤维素降解之后的二糖或单糖，被酵母菌利用吸收转化为菌体蛋白，来降低粗纤维的含量，发酵时间越长，菌种过了最高生长期，菌丝数量减少，从而使纤维素酶活力和粗蛋白含量降低，导致粗纤维含量增加。

2.3.2 混菌发酵接种量的确定

接种量对试验的结果有一定的影响，从图3、图4可以看出，多菌接种量为2 ml时，纤维素酶活性和粗蛋白含量最高，粗纤维含量最低，这是因为接种量过少产酶量也减少，降解纤维素的能力就随之下降，转化的粗蛋白的含量也减少；当菌种过量，互相又竞争生长空间和养分，进而导致微生物菌群生长不好，也符合上述菌种兼容试验的结果，故最适宜的接种量为2 ml。

表2 正交试验结果极差分析

图1 发酵时间对纤维素酶活性的影响

图2 发酵时间对粗蛋白和粗纤维含量的影响

图3 接种量对纤维素酶活性的影响

图4 接种量对粗蛋白和粗纤维含量的影响

2.3.3 混菌发酵接种比例的确定

纤维素酶在水解纤维素产葡萄糖过程中，葡萄糖和纤维素二糖对纤维素酶有很强烈的反馈抑制作用，这就影响了纤维素的水解速度和程度[8]，若能将利用纤维素水解产物的菌种和分解纤维素酶的菌种混合发酵，就能更彻底，更快的分解纤维素。本试验采用了康氏木酶、白腐菌和酵母菌的混合发酵，白腐菌能分解稻草中的木质素，为康氏木霉降解纤维素提供了便利，康氏木霉产生的纤维素酶将纤维素分解的纤维素二糖等糖类物质，酵母菌可以利用这些单糖、双糖物质生长并将培养物中的无机氮转化为菌体蛋白，从而使稻草的营养价值提高，粗纤维降低。从图5、图6可以看出康氏木霉： 白腐菌：酵母菌=1：2：1时，纤维素酶活性和蛋白质含量最大，粗纤维含量最低。

图5 接种比例对纤维素酶活性的影响

图6 接种比例对粗蛋白和粗纤维含量的影响

2.4 最优化条件的发酵试验

通过正交试验和优化单因素试验，确定了康氏木霉、白腐菌、酵母菌混合发酵稻草的最佳条件为：稻草：麸皮6：4，尿素2%，营养液60%，自然pH值。混合菌种接种量为2 ml，接种比例（康氏木霉：白腐菌：酵母菌）1：2：1，培养6 d，在此条件下进行发酵试验，试验结果见表3。

表3 最优条件下发酵产物的粗蛋白和粗纤维含量(%)

从表3可以看出，在最优的条件下，发酵最终产物中的粗蛋白含量高于以上的任何条件，为18.59%，比发酵前提高了15.1个百分点。粗纤维含量也很低，为23.17%，比发酵前降低了21.39个百分点。

3 讨论

微生物处理秸秆饲料的报道日益增多，其研究越来越受到关注，很多文献说明混菌发酵的效果要好于单一菌种的发酵效果，薛泉宏等[9]研究了2种曲霉发酵产纤维素酶的情况，结果表明2种曲霉按一定比例接种较单菌发酵产酶大幅度提高。主要因为混菌之间有共生和营养作用，能克服发酵过程中产生的不利影响，增加发酵的效果。微生物发酵秸秆饲料产纤维素酶是一种利用天然资源的有效方式，为微生物资源开发提供广阔的前景，极大地推动我国饲料和畜牧业发展。

本试验用多种菌种混合发酵稻草，利用木质素将纤维素外围包裹的木质素降解之后，促进了康氏木霉对纤维素的降解效果，分解之后的纤维素二糖和简单的糖类物质被酵母菌吸收利用合成菌体蛋白，从而达到降解粗纤维的目的，试验在室温的条件下进行的，接近实际生产效果，但还是存在一定的差距，在今后的生产中要应用各种途径和方法探索多菌发酵之间的拮抗和共生的关系，加强微生物发酵秸秆饲料工艺的研究。

4 小结

试验结果表明，康氏木霉与酵母菌之间无拮抗作用，酵母菌与白腐菌互生共利白腐菌与康氏木霉之间存在竞争性，但通过混合菌种优化条件的筛选，能降低拮抗。混合菌发酵稻草最佳培养基为：稻草：麸皮=6：4，2%的尿素，营养液60%，自然pH值。混合菌种(康氏木霉：白腐菌：酵母菌=1：2：1)接种量为2 ml，培养6 d为最佳。

[1]孙芹英，葛春梅.白腐菌混合发酵产酶及对秸秆木质纤维素的降解研究[J].工业微生物,2009,10:13.

[2]廖雪义,代青,余海忠.多种混合发酵秸秆生产蛋白质饲料的研究[J].中国饲料,2009,16:8-14.

[3]王志,陈雄,王实玉.拟康氏木霉和白腐菌混菌发酵处理稻草秸秆的研究[J].可再生资源,2009,27(4):36-38.

[4]李智明.复合菌种发酵秸秆蛋白质饲料[M].成都理工大学,2006,5:29-34.

[5]张丽英.饲料分析及饲料质量检测技术(3版)[M].北京:中国农业大学出版社，2007(10):52-56.

[6]张丽英.饲料分析及饲料质量检测技术(3版)[M].北京:中国农业大学出版社，2007(10):67-70.

[7]史国翠.康氏木霉与酵母菌混合发酵处理稻草秸秆的研究[J].湖北农业科学，2011(4):1421-1422.

[8]张英.微生物混合发酵生产纤维素酶的研究进展[J].酿酒,2010,5:20-22.

[9]薛泉宏,司美茹,等.多元混菌发酵对纤维素酶活性的影响[J].工业微生物,2004(3):30-34.