吸烟诱发的小鼠肺气肿模型的建立

邢国宏，孔立新，景洪标

肺气肿动物模型在肺气肿发病机制研究中具有特别重要的意义，建立标准化符合临床实际的肺气肿动物模型也一直是国内外学者探索的课题。木瓜蛋白酶及猪胰弹性蛋白酶等酶类气管内滴入是肺气肿动物模型制作的主要方法，近年也有基因修饰造成的肺气肿模型[1]。但这些动物模型与人类由长期吸烟慢性刺激引起的肺气肿病理变化不完全一致。为更贴近临床实际的肺气肿研究，笔者建立了香烟烟雾刺激诱发的小鼠肺气肿模型。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 鼠龄为12周的雄性C57BL6小鼠（中国医学科学院实验动物中心提供）36 只，体重（21.2±1.9） g。 随机分为 3 组，每组 12只，分别是A组 （吸烟90 d组）、B组 （吸烟180 d组）和C组（对照组）。

1.2 染毒方法 将小鼠置于自制的有机玻璃染毒箱内，80 cm×60 cm×58 cm，箱顶留有直径1.5 cm的通气孔，箱内放置钠石灰吸收二氧化碳，以无水氯化钙吸收水蒸汽。金健牌纸烟（北京卷烟厂，焦油含量14 mg）点燃后置染毒箱内，5支/次，持续30 min/次，2次/d，两次吸烟间隔4 h，吸烟之外的时间正常饲养。A组小鼠连续吸烟90 d，B组连续吸烟180 d。C组不吸烟常规饲养180 d。吸烟组小鼠于吸烟完成后当日，对照组小鼠于饲养第180天摘眼球放血处死。开胸游离心肺，气管插管并固定气管插管后，完整取出心肺组织。

1.3 支气管肺泡灌洗液（BALF）制备和细胞计数分类 经气管插管行双肺支气管肺泡灌洗（BAL）。用生理盐水0.8 ml/次分次经气管插管缓慢灌洗，连续5次，回收率均>70%。将所得BALF离心（1 500 r/min离心10 min），留取上清液他用，离心细胞沉淀用Hank’s液冲洗、离心3次，最后调整溶液为1 ml，在白细胞计数板上光镜下计数BALF中的炎症细胞总数，并制成细胞涂片，瑞氏染色后做分类计数。

1.4 肺组织病理组织学标本制备及肺气肿评价灌洗后，经气管插管25 cmH2O（1 cmH2O=0.98 kPa）压力下，以10%中性甲醛双肺灌注固定60 min，之后置肺脏于10%甲醛溶液固定24 h以上，石蜡包埋。矢状面5μm连续片制备防脱切片行HE染色，光学显微镜下观察。每个标本做2张切片，每张切片随机选取上、中、下、左和右5个视野，用HIPS-1000多功能彩色病理图文分析系统（同济医科大学千屏影像工程公司），100倍放大对每视野的肺泡数量和平均肺泡表面积进行计数测定。

1.5 统计学分析 资料建数据库，用SPSS12.0软件进行数据统计处理。所测数据先求出组内±s，组间比较采用t检验。

2 结 果

2.1 大体情况 A、B组小鼠竖毛，毛发无光泽。吸烟180 d鼠毛发稀疏，体弱瘦小。吸烟90 d后，A、B组小鼠体重偏低，但无统计学差异。吸烟180 d后，B组小鼠体重显著降低。体重比较见表1。

表1 各组小鼠吸烟前后体重（g，±s）

表1 各组小鼠吸烟前后体重（g，±s）

与C组比较，*P<0.05

组别 n 体重吸烟前 吸烟90 d 吸烟180 d A 组 12 21.4±1.6 24.4±2.4 0 B 组 12 21.1±1.5 24.3±2.3 27.4±2.6*C 组 12 21.0±1.6 25.9±2.5 30.2±2.8

2.2 BALF炎症细胞计数及分类 A、B两组小鼠BALF中炎症细胞数增加，巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞数量均显著增加，尤以B组。详见表2。而巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞各自所占比例变化不明显。

表2 各组小鼠BALF炎症细胞计数和分类计数（×108/L，±s）

表2 各组小鼠BALF炎症细胞计数和分类计数（×108/L，±s）

与 C组比较，*P<0.01；与A组比较，＃P<0.05

组别 n 白细胞总数 巨噬细胞 淋巴细胞 中性粒细胞A 组 12 14.76±1.22* 13.04±1.19* 1.49±0.16* 0.24±0.03*B 组 12 18.29±2.05＃ 15.81±1.64＃ 2.10±0.19＃ 0.37±0.05＃C 组 12 3.06±0.42 2.73±0.33 0.30±0.04 0.03±0.01

2.3 肺组织病理学改变 B组小鼠肺组织病理切片HE染色，肺内细支气管、终末细支气管表现出不同程度的慢性炎性细胞、中性粒细胞、淋巴细胞浸润及分泌物阻塞；肺内呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊及肺泡明显扩大，肺泡间隔、肺泡壁多处断裂，局部炎症细胞浸润，部分肺泡互相融合形成肺大泡。A组小鼠肺组织可见炎症改变，肺泡壁破坏不明显。C组肺组织学无异常。各组小鼠平均肺泡面积分别是，A 组（5 859.99±252.78） μm2，B 组（14 776.71±637.57）μm2，C 组 （4 825.05±238.47）μm2。 B 组和 C组比较，有非常显著性差异（P<0.01）；B组和A组之间也有非常显著性差异（P<0.01）；A组和C组之间差异不显著。

3 讨 论

肺气肿是危害人类健康的常见疾病，虽然对其发病机理有很多的研究，但其发病机制仍未完全阐明。肺气肿是一种慢性进展性疾病，所以对人体进行直接研究有很大的局限，往往是窥豹之一斑。因而动物模型在该病相关的基础及临床研究中，较之其他疾病，作用更加突出。建立标准化符合临床实际的肺气肿动物模型，一直是国内外学者探索的课题。所谓符合临床实际，很重要的一点就是动物疾病制模过程中的致病因素与临床一致。现已公认，吸烟是肺气肿的最主要致病因素。本研究模拟了临床患者的慢性吸烟过程。实验结果显示，小鼠吸烟后BALF中炎症细胞数量增加，肺组织出现炎症改变，到吸烟180 d时肺内呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊及肺泡明显扩大，肺泡间隔、肺泡壁多处断裂，部分肺泡互相融合形成肺大泡，出现了明显的肺气肿改变。

吸烟是引起肺气肿发病的最主要原因，但吸烟引起肺气肿的机制仍不十分清楚。有研究表明，烟草烟雾有直接毒害作用，能使支气管上皮纤毛变短、不规则，纤毛运动发生障碍，削弱肺泡吞噬细胞的吞噬、灭菌作用，导致黏膜纤毛系统结构和功能异常，引起支气管痉挛，增加气道阻力。烟草烟雾过度接触，会造成细胞坏死。更重要的是，而坏死细胞释放的细胞内酶及溶酶体内容物可以放大组织损伤，造成炎症细胞聚集，致周围组织损害[2]。烟雾中存在大量氧化剂和自由基，可引起呼吸系统组织细胞的氧化剂和抗氧化失平衡，直接损伤细胞功能，烟草烟雾中的氧化剂可以直接破坏肺组织细胞基质成分，烟草烟雾还可以干扰弹性蛋白的合成和修复[3]。吸烟刺激呼吸道上皮细胞释放IL-8、细胞间粘附分子-1及转化生长因子，向气道募集白细胞，造成炎症反应[4]。吸烟可以激活巨噬细胞释放炎性介质，诸如肿瘤坏死因子-α、IL-8、单核细胞趋化肽－1和白三烯B4。巨噬细胞也产生蛋白水解酶，如基质金属蛋白酶－2、－9和－12， 组织蛋白酶 K、L 及 S。Lim等研究证明慢性阻塞性肺疾病患者巨噬细胞合成释放炎性介质的能力更强，并随着反复的烟草烟雾暴露，这种活性会进一步加强[5]。近年研究认为细胞凋亡是肺气肿发生机制之一，已有资料证实吸烟可诱发Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡[6]。

由于肺气肿患病者数多、病死率高，已成为全球性的公共卫生问题，因此深入肺气肿发病机理研究具有重要的临床和社会意义。全球8O%的肺气肿患者与长期大量吸烟有关。吸烟诱发的小鼠肺气肿模型能较好地模拟人类肺气肿的发病过程，可能为肺气肿基础和临床研究提供一种更确切实用的工具。

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