黄芪多糖的萃取提纯及组分鉴定

宋建华，刘玉玲

黄芪为我国传统中药，在我国分布地域广，具有补气、升阳、益卫、固表、利水等作用，现代药理学研究结果表明，黄芪含有多种有效成分，如皂甙类、多糖类等，其中多糖类组分是发挥补中益气作用的主要成分，具有抗肿瘤活性[1]。中药多糖组分的提取方法较多，但提取物多含较多蛋白、纤维等杂质，影响其使用效果。本文建立了高纯度黄芪多糖的提取、纯化方法，并对黄芪多糖主要组分进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂 黄芪（产地山西沁源县，3年生，经中医专家鉴定为绵黄芪），95%乙醇 （阿拉丁试剂上海有限公司），盐酸（阿拉丁试剂上海有限公司），乙醚、苯酚（北京化工厂），蒸馏水（实验室制备）。

1.2 仪器 高效液相仪（淮安瑞美克仪器有限公司），紫外光谱仪（美国McPherson公司），FA135S型电子天平（上海豪昇科学仪器有限公司），氢氧化钠 （碧云天生物试剂有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 粗多糖的提取 黄芪烘干恒重后粉碎，2号筛筛选粉末，称取 100 g，置提取器中，加蒸馏水浸泡 12 h（W∶W=1∶5），11 000 g×min高速离心离心10 min，保留上清。沉淀再加蒸馏水浸泡 12h（W∶W=1∶5），11000g×min 高速离心离心 10min，保留上清，弃去沉淀。合并上清液，加入4倍体积的95%乙醇，静置 1 h，2 500 g×min 5 ℃低温离心 20 min，收集沉淀，冷冻干燥后得淡黄色粗多糖。

1.3.2 粗多糖的纯化 粗多糖溶入适量蒸馏水中，采用Sevag法除去蛋白，置DEAE-52离子交换柱（2.5 cm×32 cm）洗脱（洗脱液：pH 8.0，0.45%NaCl，流速：50 ml/h）。洗脱液采用Sephadex G-200凝胶柱层析。各组分经透析、浓缩、醇沉、洗涤、真空冷冻干燥，得纯化黄芪多糖。

1.3.3 纯化多糖纯度检测

1.3.3.1 多糖标准曲线制备 精密称取恒重无水葡萄糖15 mg，用蒸馏水定容至100 ml，吸取定容后葡萄糖溶液依次梯度稀释为15.0～105.0 μg/ml标准液，于各管中分别加入60 g/L的苯酚溶液0.6 ml，浓硫酸3 ml，漩涡振荡后静置15 min，采用紫外光谱仪与490 nm处扫描，测定吸光度，空白校正采用蒸馏水，以吸光度（Y）对相应浓度（X，mol/L）进行线性回归分析，绘制标准曲线。

1.3.3.2 蛋白标准曲线制备 精密称取牛血清白蛋白4 mg，生理盐水定容为100 ml，吸取定容后牛血清白蛋白溶液依次梯度稀释为5.0～30.0 μg/ml标准液，于各管中依次加入Serva blue-G工作液1 ml，涡旋振荡后静置10 min，采用紫外光谱仪与595 nm处扫描，测定吸光度，空白校正采用生理盐水，以吸光度（Y）对相应浓度（X,mol/L）进行线性回归分析,绘制标准曲线。

1.3.3.3 多糖含量及纯度测定 分别取纯化黄芪多糖及粗多糖1 g，加蒸馏水1 000 ml，配制成1 mg/ml多糖溶液，分别在波长490及595 nm处扫描，测定吸光度，依据标准曲线回归方程计算化多糖及和蛋白杂质含量。

1.3.4 多糖组分分析

1.3.4.1 标准曲线绘制 准确称取葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、木二糖、燕麦-葡聚糖各0.25 g，分别用超纯水定容至25 ml。用超纯水稀释至20 g/L，用 0.22 μm水性滤膜过滤，柱温30℃，洗脱液16 mmol/L、NaOH溶液，进样量200 μl，流速1 ml/min色谱条件下将各质量浓度的样品进样，测定其峰面积，以单糖标准品峰面积（Y）对相应浓度（X,mol/L）进行线性回归分析，绘制标准曲线。

1.3.4.2 纯化黄芪多糖组分鉴定 纯化黄芪多糖5 mg，加入1.5 ml 5 mol/L三氟乙酸溶液，封管，水解。0.22 μm无菌滤膜过滤，取 0.1 ml过滤液，10 ml定容。采用高效液相色谱仪进样检测,检测条件，离子柱 CarbopaeTMPAI，柱温 30℃，洗脱液 16 mmol/L、NaOH 溶液，进样量 200 μl，流速 1 ml/min，测定其各峰面积，依据标准曲线，计算相应组分含量。

2 结 果

紫外光谱扫描后依据标准曲线计算水体醇沉法提取黄芪多糖纯度为32%，进行层析提纯后黄芪多糖纯度为89%，纯化后黄芪多糖蛋白杂质含量约为1.5%。高效液相色谱分析结果显示，黄芪多糖的组成成分包括葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖及乳糖等，其中葡萄糖及木糖是主要组成成分，浓度分别为2.84%及1.67%，黄芪多糖的组分按浓度计，分别为葡萄糖2.84%，木糖1.67%，果糖0.5%，蔗糖0.4%，麦芽糖和乳糖<0.4%。见图1。

图1 黄芪多糖高效液相色谱图

3 讨 论

多糖是黄芪的有效成分之一，多糖成分萃取是其中药制剂工艺之一，水提醇沉法是多糖提取的经典工艺，能够去除不溶性杂质[2]，但既往的研究发现，水提醇沉法提取的中药多糖成分的纯度较低，蛋白杂质含量较高，蛋白杂质容易引起过敏反应等不良反应，对于针剂等纯度要求较高的剂型不能满足需要。笔者在研究中发现，采用水提醇沉提取的黄芪多糖其纯度为32%，含有较多的杂质。凝胶柱层析是药物组分提纯的常用方法，该方法性能稳定，利用层析液的电荷吸引，对于多糖类物质的分离纯化具有较好的效果[3]，有研究对香菇多糖提取，其纯度接近80%[4]。在研究中对黄芪多糖采用水提醇沉法初步粗提，获粗制的黄芪多糖，然后采取纤维素凝胶柱层析，提取的多糖纯度达到89%，其中蛋白质杂质含量不足2%，进一步对其组分进行高效液相色谱分析发现，其主要成分为葡萄糖及木糖，尚有少量的蔗糖、果糖等成分。本文结果说明采用水提醇沉结合纤维素凝胶柱层析能够提取高纯度的黄芪多糖。

[1]郑 举，刘红云.HPLC-ELSD测定黄芪多糖注射液中黄芪甲苷的含量[J].中国兽药杂志，2010，44(7)：16-18.

[2]刘晔玮，宋 海，马振远，等.甘草多糖提取工艺的研究[J].中成药，2006，28（6）：729-731.

[3]朱德艳.几种香菇多糖纯化方法的比较[J].农产品加工.创新版，2009，4（4）：14-15.

[4]屈永年，曾凡龙，高海涛，等.香菇多糖的提取和纯化的研究[J].数理医药学杂志，2003，16（6）：537-538.