肝纤维化患者“益肝康”药物血清对HSCs胞浆游离钙的影响

王军民 刘石萍 方澍名 姚希贤

肝纤维化(LF)是所有慢性肝病进展成肝硬化的必经阶段，而肝纤维化发生的中心环节则是肝星状细胞(HSCs)的活化与增殖，因此抑制HSCs活化与增殖则成为阻止并逆转肝纤维化的主要途径之一。经大量临床与基础研究证实，中药有效方剂“益肝康”对肝纤维化有相当的治疗作用［1］。目前尚乏慢性乙型肝炎患者“益肝康”药物血清对HSCs细胞内Ca2+信号转导机制影响的研究。本实验采用激光共聚焦显微镜(LSCM)与第三代钙荧光探针Fluo-3/AM技术，观察经用慢性乙型肝炎患者制备的“益肝康”药物血清对血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)介导的HSCs胞浆游离钙(Ca2+i)变化的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 病例选择:河北医科大学第二医院消化内科门诊就诊及病房住院之慢性乙型肝炎患者。

1.2 纳入标准 (1)符合5中华医学会传染病与寄生虫病学分会肝病学分会、病毒性肝炎防治方案6慢性乙型肝炎诊断标准;(2)年龄18～55岁，性别男性;(3)HBVDNA(+)的“小三阳”患者;(4)肝纤维化血清标志物肝纤四项(HA、LN、PⅢP、IV-7s)有阳性表现;(5)影像学检查脾脏脾门处厚度4～4.5 cm，门静脉主干及脾门静脉内径正常;(6)研究期间同意不服用免疫调节剂、退黄药物及其他中药。

1.3 排除标准 (1)合并其他类型肝炎者;(2)严重心、肾疾患者;(3)胆红素＞5ULN;(4)近期(6个月)应用免疫抑制或增强剂者;(5)肝硬化失代偿期患者。

1.4 细胞株 肝星状细胞株CFSC由美国Greenwel教授建株并惠赠，其表型为活化的HSCs，从四氯化碳(CCl4)诱发的肝硬化大鼠中分离并通过培养使细胞自发获得永生性［4］，冷冻保存于液氮中。

1.5 液体配制

1.5.1 正常含钙细胞培养液/台氏液:NaCl 130 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，CaCl21.5 mmol/L，MgCl22 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，glucose 10 mmol/L，pH 值7.4(NaOH)。

1.5.2 青霉素、链霉素双抗溶液:使用浓度青霉素为100 U/ml，链霉素 100 μg/ml，配成 100 倍贮存液，－20℃ 贮存备用。

1.6 方法

1.6.1 药物血清的提取及细胞培养:采用改良血清药理学方法，即采用慢性乙型肝炎患者进行药物实验，再提取药物血清进行体外细胞培养，使体外实验尽量准确再现在体药物与机体相互作用过程。

1.6.2 患者血清分组:A组:服用“益肝康”前;B组:服用“益肝康”后。

1.6.3 药物血清的制备:征求患者同意，签定同意书，15名观察对象服药前采静脉血5 ml，然后给予“益肝康”150 ml(1袋)，2次/d，疗程7 d时作为观察终点。服用“益肝康”前后，均于晨起外周静脉取血，常温静置3 h，4℃离心，3000 r/min，20 min，分离血清，其中有溶血者弃之不用。同组血清合并混匀，56℃ ×30 min水浴灭活，用0.22 μm 滤器过滤除菌，－70℃保存备用。

1.6.4 细胞培养 将冷冻保存于液氮中的HSCs复苏后接种于含10% 胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、4 mmol/L L-谷氨酰胺及1 mol/LHEPES的10%RPMI-1640培养液(pH值7.4)中，37℃、5%CO2条件下培养。当细胞呈单层致密状时，用0.25%胰蛋白酶消化后以1∶3传代，24 h换液，72 h再次传代。

1.6.5 实验分组:每次实验均在呈指数生长的细胞中进行，将2 cm×2 cm盖玻片预先放置在6孔培养板，细胞消化后以1.0×104/ml的密度接种2 ml制备爬片，培养箱中孵育至细胞80%融合时，弃培养液，换不含胎牛血清的细胞培养液继续培养24 h，使细胞基本同步化于G0期后进行实验。实验细胞分组如下(n=8):A组为服用“益肝康”前血清干预组;B组为服用“益肝康”后药物血清干预组

1.6.6 药物血清预处理:将上述爬片细胞分为2组，每孔加入10%RPMI-1640培养液900 μl，然后各实验孔采用盲法分别给予A组药物血清或B组血清100 μl，终浓度为10%。继续培养24 h后进行实验。

1.7 检测胞浆游离钙 采用盲法，用10%药物血清培养HSCs24 h，再将经药物血清预处理的HSCs及对照组细胞负载Fluo-3/AM后使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测Ca2+i。

1.8 统计学分析应用SPSS 12.0统计软件，计量资料以表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HSCs的Ca2+荧光成像 LSCM下Ca2+成像的HSCs仍可见普通倒置显微镜下的形态特征，细胞Ca2+i的浓度的高低由细胞被激发出的荧光强弱表示，荧光强度越强，表示Ca2+i浓度越高，反之则越低。本实验HSCs与Fluo-3/AM孵育后，所有细胞均被染色，且每组各细胞间的强度基本一致。

2.2 静息状态下HSCsCa2+i的动态变化 为证明细胞培养液本身对HSCsCa2+i的影响，本研究观察了6个HSCs在实验所需的时间内(5 min)Ca2+i的动态变化，结果表明，HSCs在实验所需的整个时间内Ca2+i荧光强度基本保持稳定。

2.3 不同浓度Ang-Ⅱ对HSCs的累积反应曲线 加入浓度梯度Ang-Ⅱ后，HSCs荧光强度逐渐增加，作出累积反应曲线后，得到EC50值约为1.1×10-7mol/L。

2.4 “益肝康”药物血清对HSCsCa2+i的影响 经“益肝康”药物血清预处理HSCs后均可明显减低细胞Ca2+i，荧光强度相对值(FI)与经服药前患者血清预处理HSCs组结果相比，Ca2+i下降达52.37%，两者相比差异有统计学意义(P ＜0.01)。见表 1、图 1。

2.5 “益肝康”药物血清对Ang-Ⅱ介导的HSCsCa2+i变化的影响 给予 Ang-Ⅱ(1.1×10－7mol/L)刺激 HSCs，经“益肝康”药物血清预处理的HSCs，细胞Ca2+i荧光强度变化百分数(CRF)明显减低，同经服药前患者血清预处理HSCs组结果相比，下降达90.50%，差异有统计学意义(P ＜0.01)。见表1、图2。

3 讨论

图1 “益肝康”药物血清对HSCs胞浆游离钙荧光强度相对值的影响

图2 “益肝康”药物血清浆游高钙荧光强度变化百分数的影响

表1 “益肝康”药物血清对胞浆游离钙荧光强度相对值及变化百分数的影响n=8，

表1 “益肝康”药物血清对胞浆游离钙荧光强度相对值及变化百分数的影响n=8，

注:与A组比较，*P ＜0.01

组别FI CRF A组53 ±15 1.000 ±0.370 B 组 25 ±7* 0.095 ±0.028*

目前研究认为，生物信号跨膜转导的基本途径包括cAMP、cGMP、三磷酸肌醇(IP3)和Ca2+等系统。其中作为“信使之王”的Ca2+尤为重要，而其在细胞内浓度的增加是细胞增殖分裂不可缺少的条件。在HSCs活化过程中，其胞浆内Ca2+的是诸多生长因子、细胞因子及氧化应激产物等发挥促生长和增殖作用的主要介质之一。最近的许多实验证实，HSCs上存在着L型-电压依赖性钙通道(L型-VOCC)，Oide等［2］发现 HSCs尚含有T型电压依赖性钙通道(T型-VOCC)，且可被TGF-1激活。细胞外Ca2+可通过被激活的Ca2+通道流入细胞内，加之胞内钙库受损使Ca2+大量释放，引起Ca2+i持续性升高，细胞内外Ca2+i梯度降低，细胞去极化，兴奋性增加，从而激活HSCs，使其增殖并大量表达胶原蛋白，加速肝纤维化的形成。郭传勇等［3］观察内皮素-1对培养鼠肝星状细胞的影响，发现内皮素-1在促进HSCs增殖及胶原合成的同时，细胞内游离钙的水平也显著升高，且Ca2+i浓度升高呈双相反应，一是快速短暂的瞬时峰值升高相(Ⅰ相);二是缓慢持久升高相 (Ⅱ相)。而且上述作用呈剂量依赖关系。推测Ⅱ相升高起主要作用，可进一步激活c-fos、c-myc等癌基因表达，籍此调节HSCs细胞分裂和增殖的功能，并使HSCs分泌ECM能力增强。钟敏章等［4］在实验中发现，用汉防己碱及维拉帕米治疗可使HSCs数目减少，内质网面积减少，线粒体、高尔基体产生与分泌胶原的细胞器均受到抑制，说明钙通道阻断剂抗肝纤维化作用部分与其抑制HSCs增殖及其向肌成纤维样细胞转化有关，也暗示Ca2+i在HSCs活化与增殖中起着重要作用。

有研究表明，丹参及其提取物可抑制心肌细胞及内皮细胞应激所致钙超载［5］，本实验结果表明，经慢性乙型肝炎患者提取的“益肝康”药物血清预处理HSCs，与服药前提取的患者血清预处理HSCs相比，前者钙荧光强度明显低于后者(P＜0.01)，显示“益肝康”药物血清显著抑制了HSCs细胞内钙的升高。其机制可能是经含药血清的培养基培养24 h后，药物发挥了其抑制HSCs钙动员的作用，推测该作用可能与“益肝康”的主药-丹参阻断了HSCs细胞膜上的L型-VOCC从而减少了钙离子的内流有关。

本研究结果显示，在受到不同浓度的AngⅡ刺激时，HSCs-Ca2+i与AngⅡ成量效关系。提示AngⅡ可以通过提高Ca2+i而在HSCs的增殖中发挥重要作用。本实验结果尚表明，给予Ang-Ⅱ刺激后，“益肝康”药物血清预处理的HSCs，其Ca2+i荧光强度变化百分数明显低于服药前血清预处理的HSCs(P＜0.001)，提示“益肝康”阻断或抑制了HSCs的Ang-Ⅱ信号转导通路，该通路可能是 Ang-Ⅱ激活的受体依赖性钙通道(ROCC)，从而抑制了其致HSCs内钙升高的作用，并因此抑制HSCs活化与增殖。此机制可能与“益肝康”的主要组分——丹参下调AT-1受体水平密切相关。

1 房澍名，姚冬梅，王军民，等.益肝康及其拆方对肝星状细胞活化增殖及胶原代谢影响的研究.河北医药，2008，30:1481-1482.

2 Oide H，Itatsu T，Hirose M，et al.Acute and chronic effect of alcohol on Ca2+channels in hepatic stellate cells.Alcohol Clin Exp Res，2000，24:357-360.

3 郭传勇，邬赞斌，伍建业，等.内皮素-1对培养鼠肝星状细胞内游离钙的影响.中国病理生理杂志，2004，20:2118-2119.

4 钟敏章，郭传勇，王炳芳，等.内皮素-1对肝星状细胞增殖及胶原合成与分泌的调控作用.同济大学学报，2002，23:273-275.

5 李金凤，王孝铭，徐长庆，等.利用激光扫描共聚焦显微镜观察丹参滴丸对乳鼠心肌细胞缺氧的保护作用.中国病理生理杂志，2000，16:1026.