黄连、大黄和苦参联合应用对金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性研究

任书青 杨继章 王长友

金黄色葡萄球菌(MRSA)是社区、医院中内源和外源性感染的主要病原菌，它致病性广，耐药性产生快;甲氧西林自1959年开始用于治疗耐青霉素的葡萄球菌感染，1961年就产生了耐甲氧西林的MRSA。近年MRSA的阳性率迅速上升，其多重耐药谱也不断扩大，再加上其耐药性传递及多重耐药谱迅速扩大的机制至今还未阐明，MRSA已成为了世界性难题。MRSA对氨苄西林、四环素、利福平、亚胺培南、环丙沙星、庆大霉素、头孢噻吩、头孢噻肟、头孢唑林的耐药率均大于90.0%，对红霉素、克林霉素和克拉霉素的耐药率逐年下降;还未发现耐万古霉素的MRSA［1］。因此，探讨新的抗MRSA感染的药物，已迫在眉睫。中草药与西药配伍尚能逆转西药的耐药性［3］，因此，探讨中西药的配伍也具有广阔的前景。

1 材料与方法

1.1 试药 黄连(产地:四川)、大黄(产地:甘肃)、苦参(产地:内蒙古)由河北医科大学第一医院主管中药师张一民鉴定为真品。MRSA菌种(临床标本分离菌株，由河北医科大学第一医院临床检验中心提供)。ATCC25923标准金黄色葡萄球菌株(标准菌株，河北耐药监测中心提供)。MH培养基(北京三药科技开发公司);MH肉汤(北京陆桥技术有限责任公司)。

1.2 仪器 TDR-200B型自动微生物鉴定系统(湖南长沙天地人生物科技有限公司);DL-CJ-1F实验医用型洁净工作台(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司北京分公司);DH3600AB型电热恒温培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司);一次性使用培养板(姜堰市天力医疗器械有限公司，批号:20090218)。一次性痰杯(姜堰市瑞康医疗器械有限公司，批号:20090118)。

1.3 方法

1.3.1 药液的准备:取黄连、大黄和苦参，各3份，每份50 g，单独和两两等比例混合后加适量的水浸泡30 min，然后用水煎煮，第1次1.0 h，第2、3次各0.5 h。合并3次滤液，加热浓缩使原药液浓度为1 g/ml;沸水浴灭菌45 min;再将黄连、大黄、黄连和大黄配伍液、黄连和苦参配伍液稀释到100 mg/ml，备用。

1.3.2 药液的配制:采用二倍稀释法:取含8排12孔的一次性使用培养板，分别标记，在标号1～12孔中各加入MH肉汤培养液100 μl，在每排的第1孔各加入原药液(100 mg/ml)100 μl，将第1孔混匀后，抽取100 μl加入第2孔，将第2孔混匀后再抽取100 μl加入第3孔，依次倍比稀释至第10孔，将第10孔混匀后抽取100 μl弃取，第11孔为阴性对照，第12孔为阳性对照。1 ～10 孔中药液浓度依次为:50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.57、0.79、0.39、0.20、0.10 mg/ml。其中苦参及大黄和苦参的药液浓度 1 ～10 孔依次为:500.00、250.00、125.00、62.50、31.30、15.70、7.90、3.90、2.00、1.00 mg/ml。

1.3.3 菌种的制备:用接种环挑取MRSA菌落，接种于MH肉汤培养基中，置37℃培养24 h，用接种环挑取较大菌落2～3个，移至2 ml灭菌注射用水中，待检前调节菌液浓度至0.5麦氏比浊管浊度。用 MH肉汤培养液1∶10稀释(含菌量为107cfu/ml)，供测定MIC用。

1.3.4 接种:用微量加样器取100 μl MRSA菌液，依次加入各孔中(第11孔除外)，37℃恒温培养24 h，观察细菌生长情况，培养液澄清的为阴性(即无细菌生长)，培养液混浊的为阳性(即有细菌生长)。以此确定药液的MIC，MIC50，MIC90值。

2 结果

2.1 黄连、大黄、苦参单药及两两配伍后对MRSA的 MIC，MIC50，MIC90值 见表1。

2.2 FIC指数计算 FIC指数=A药联合时MIC/A药单用时MIC+B药联合时MIC/B药单用时MIC。当FIC指数≤0.5时，为协同作用;当1≥FIC指数＞0.5时，为相加作用;当2≥FIC指数＞1时，药物体外的相互作用方式为无关;当FIC指数＞2时，为拮抗作用。

表1 黄连、大黄、苦参及其相互配伍后对MRSA 的 MIC、MIC50、MIC90 值 mg/ml

对MIC90其FIC指数如下:(1)黄连-大黄FIC指数=4.21，FIC 指数 ＞2，为拮抗作用;(2)黄连-苦参 FIC 指数 =1.01，2≥FIC指数＞1，药物体外的相互作用方式为无关;(3)大黄-苦参 FIC 指数 =0.69，1≥FIC 指数 ＞0.5时，为相加作用。

对MIC50 FIC指数如下:(1)黄连-大黄FIC指数 =4.28，FIC指数 ＞2，为拮抗作用;(2)黄连-苦参 FIC指数 =1.01，2≥FIC指数＞1，药物体外的相互作用方式为无关;(3)大黄-苦参FIC 指数 =0.69，1≥FIC 指数 ＞0.5时，为相加作用。

3 讨论

中草药与抗生素相比具有以下优点［3］:(1)具备非特异性抗菌作用并能调节及提高机体免疫力;(2)不良反应小，在体内药物残留量低;(3)细菌较少对中药产生耐药。因此，研究探索抗MRSA的中草药前景广阔。

黄连具有良好的抗菌作用，而且与多种中草药配伍呈现出协同作用，在临床应用广泛，是一种具有广阔前景的中草药［4，5］。但由于黄连中含有大量生物碱，当与大多数中草药配伍时，易产生沉淀，从而影响其药效的发挥。因此，对含有黄连的复方制剂的提取，应从工艺上进行改进，以减少沉淀的产生，充分发挥黄连的疗效。

本研究显示，无论对MIC50而言，还是对MIC90而言，黄连与大黄配伍均呈现出拮抗作用，黄连和苦参配伍呈现无关作用，只有大黄和苦参配伍方呈现出相加作用。

本课题旨在探讨中草药联合应用对MRSA感染的治疗作用，从本次试验数据来看，大黄和苦参配伍呈现相加作用，黄连与大黄配伍呈现拮抗作用，黄连和苦参配伍呈现无关作用，但这仅代表体外作用的结果，至于体内作用如何，有待进一步的研究。本文采用水煎剂型，与临床常用的服药剂型相同，结果具有可借鉴性。

1 郭靓，范红，陈知行，等.华西医院5年耐甲氧西林金黄色葡萄球菌医院感染调查.中华医院感染学杂志，2009，19:1151-1154.

2 曾春兰，钟振国.中药抗菌作用的研究进展.广西中医学院学报，2006，9:51-53.

3 陈勇川，谢林利，熊丽蓉，等.黄芩苷/黄芩素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗药性的逆转作用研究.中国药房，2008，19:644-645.

4 徐帆，李平，楚更五，等.3种中药提取物对幽门螺杆菌的体外联合抗菌效应研究.中国药房，2007，18:2573-2574.

5 任书青，曹德英，杨继章，等.五倍子、黄芩和黄连联合应用对MRSA的体外抗菌活性研究.中国药房，2010，21:198-199.