茯砖茶水提物对大肠杆菌感染小鼠的免疫调节作用

刘平，李宗军,2*，许爱清,3

(1. 湖南农业大学 食品科学技术学院，湖南 长沙 410128；2. 国家植物功能成分利用工程技术中心功能食品分中心，湖南 长沙 410128；3. 湖南科技大学 生命科学学院，湖南 湘潭 411201)

茯砖是一种砖形蒸压黑茶。目前，对茯砖茶功能的研究主要集中在减肥、降血脂方面[1]，而关于其对免疫系统影响的研究较少。笔者以细菌感染小鼠为模型，研究茯砖茶水提物对模型小鼠免疫功能的影响。现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 供试动物

昆明种SPF小鼠190只，雌、雄各半，体质量(20±2)g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,许可证号码为SCXX(湘)2009–0004。鼠颗粒饲料由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。供试小鼠均饲喂在湖南农业大学动物科学院标准动物房，适应性喂养3 d后开始试验。

1.1.2 茯砖茶水提物

金湘益茯砖茶由湖南益阳茶厂提供。取 100 g茯砖茶敲碎，浸泡于400 mL蒸馏水中，搅拌，煮沸15 min，静置冷却1 h，过滤后定容至100 mL，制成高剂量茶汁(1 g/mL)，再分别用无菌生理盐水稀释至中剂量(0.5 g/mL)、低剂量 (0.05 g/mL)茶汁，备用。

1.1.3 攻毒菌液

Escherichia coli O157:H7(21530)菌种购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。活化后接种 2 mL菌悬液到100 mL液体培养基，37 ℃摇床培养18 h。将培养好的菌液离心，用无菌生理盐水洗涤3次，收集菌体，加适量无菌生理盐水，据预试验结果以OD600nm1.0的菌液作为攻毒菌液。

1.1.4 主要试剂

主要试剂：E. coli O157:H7检测试剂盒；绵羊血；印度墨汁；兔抗小鼠CD4和CD8单克隆抗体(Epitomics)；Envision二步法通用型抗小鼠免疫组化试剂盒和DAB显色剂试剂盒(Novocastra)。

1.2 方 法

将190只昆明小鼠适应性喂养3 d后随机分成5组：对照组(A组)、模型组(B组)、低剂量茶汁组(1 g/(kg·d)，C 组)、中剂量茶汁组(10 g/(kg·d)，D 组)、高剂量茶汁组(20 g/(kg·d)，E组)。以体质量60 kg的成人日消耗茯砖茶不超过8 g的推荐量计算，C、D、E组的剂量分别相当于人类推荐量的1、10、20倍。分别给低、中、高剂量组小鼠灌胃相应剂量茶汁3 d后，将此3组和模型组小鼠灌胃E. coli O157:H7菌液造模，造模方法参照文献[2]，并根据预试验结果，选取能使小鼠感染E. coli O157:H7但不致死的剂量为攻毒菌液。攻毒途径为经口灌胃。每只小鼠灌胃OD600nm为1.0的菌液0.4 mL。攻毒后3 h于无菌条件下取各组小鼠粪便标本，用E. coli O157试剂盒检测粪便中的E. coli O157。模型复制后，每天定时一次性给低、中、高剂量组小鼠灌胃相应剂量茶汁，给模型组灌胃生理盐水，灌胃量均为每只小鼠0.4 mL。对照组不做任何处理。试验期间各组小鼠自由饮水和采食，连续10 d后处死。

1.2.1 测定指标及方法

1) 非特异性免疫功能指标的测定。免疫器官指数测定：于每组各取 10只小鼠，用颈椎脱臼的方法将其处死后解剖，摘取脾脏和胸腺，称重，计算免疫器官指数。

免疫器官指数=免疫器官质量(mg)/体质量(g)。

单核–巨噬细胞吞噬功能[3]检测：于每组各取10只小鼠，称重，按小鼠体质量的0.1 mL/(10 g)剂量从尾静脉注入稀释 3～4倍的印度墨汁。分别于2、10 min(分别记为t1，t2)后从内眦静脉丛取血20 μL，加到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，测定光密度值OD600nm(分别记为D1，D2)。将采血后小鼠处死，分别称其肝质量和脾质量，计算廓清指数和吞噬系数。

吞噬系数=(体质量/肝脾总质量)×廓清指数1/3。2)体液免疫功能检测。血清溶血素测定[3]：取绵羊血离心后，得压积绵羊红细胞(SRBC)，并配成2%的细胞悬液。造模后6 d，于各组随机选10只小鼠，在每只小鼠的腹腔注射0.2 mL SRBC悬液进行免疫。4 d后摘除小鼠的眼球，采血。用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝试验板内，每孔100 μL，再加入100 μL 0.5%的SRBC悬液，混匀，于37 ℃温箱孵育3 h，观察血球凝集程度。

3) 肠道局部免疫功能检测。用免疫组化方法显示肠黏膜上CD4+T细胞和CD8+T细胞抗原分子的表达并计数。于各组各取 10只小鼠处死后，将其十二指肠、回肠、结肠组织固定于10%的甲醛溶液中，脱水，用常规石蜡包埋、切片，脱蜡至水。将切片置于0.3%H2O2液中15 min。加入相应一抗于湿盒中4 ℃过夜。滴加二抗，室温孵育1 h，用DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。以PBS代替一抗，用相同方法做对照试验。在光学显微镜下，在每只小鼠的十二指肠、回肠、结肠各取4个区域，统计 4个高倍镜视野下肠黏膜上 CD4+T细胞和CD8+T细胞的数目。

1.3 数据处理

用Excel 2003和SPSS 11.5软件对试验数据进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 小鼠的临床表现

试验期间，A 组(对照组)小鼠活泼好动，毛色正常，抓尾反抗力强，无明显临床症状； B～E组小鼠都存在毛发蓬松、活动减少、抓尾反抗力弱等现象。经检测，B～E组小鼠粪便的E. coli O157:H7阳性率为 100%，A组小鼠均为阴性，表明造模成功。在攻毒3 d后，C～E组小鼠的临床症状有不同程度改善，小鼠毛色渐趋正常，活动增多，抓尾反抗力增强。

2.2 小鼠的免疫器官指数和碳廓清试验结果

由表1可见，茶汁中、高剂量组胸腺指数均显著高于模型组(P＜0.05)，且中剂量组与模型组差异极显著(P＜0.01)。脾指数各组差异不显著。

表1 各组小鼠的免疫器官指数Table1 Immune organ indexes of in mice

碳廓清试验结果显示，模型组、对照组的吞噬系数分别为3.93、5.07，二者差异极显著(P＜0.01)；茶汁低剂量组吞噬系数为4.92，与模型组差异显著(P＜0.05)，中、高剂量组吞噬系数分别为5.31、5.27，均与模型组差异极显著(P＜0.01)。

2.3 小鼠的血清溶血素试验结果

试验结果显示，模型组、对照组小鼠的血清溶血素抗体积数分别为 37.2、44.6，二者差异显著(P＜0.05)；茶汁中剂量组血清溶血素抗体积数为45.5，显著高于模型组(P＜0.05)；高剂量组血清溶血素抗体积数为46.7，极显著高于模型组(P＜0.01)。

2.4 小鼠肠道黏膜上CD4+T和CD8+T细胞的表达

免疫组织化学法显示，在小鼠的十二指肠、回肠、结肠均有CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的表达。CD4+T淋巴细胞主要位于肠黏膜固有层，上皮内也有少量。CD8+T淋巴细胞主要位于肠黏膜上皮细胞基底层，在肠黏膜固有层也有表达。模型组CD4+T和CD8+T淋巴细胞的数量显著低于对照组(P＜0.05)。茶汁中、高剂量组的细胞数目显著高于模型组(P＜0.05)。

表2 各组小鼠的CD4+T和CD8+T淋巴细胞Table 2 CD4+ and CD8+ T-lymphocytes in mice

3 结论与讨论

本研究结果表明：茯砖茶能提高小鼠的免疫功能，且呈一定的量效关系，中、高剂量比低剂量效果明显。本试验中成功复制了E. coli O157:H7感染的模型，被感染的模型组小鼠的非特异免疫、体液免疫和肠道局部免疫功能均比对照组低。灌服中、高剂量茯砖茶水提物能直接刺激模型小鼠胸腺的发育，提高其中枢免疫器官的质量；促进B细胞产生抗体，提高其体液的免疫功能；增加肠道局部CD4+T和CD8+T淋巴细胞数目，提高T淋巴细胞的活性，增强细胞的免疫功能；灌服低、中、高剂量的茯砖茶水提物均能提高单核-巨噬细胞的吞噬功能，增强小鼠的非特异性免疫功能。

推测茯砖茶水提物是通过多环节、多靶点影响免疫系统的。这可能是茯砖茶防治E.coli O157：H7感染的机制之一。茶叶中的功能性成分如茶氨酸、茶多糖和茶多酚等已被证实在调节免疫方面有重要作用[4–8]。茯砖茶中的茶多糖、茶多酚含量较高，这些活性物质有增强免疫功能的作用。在茯砖茶独有“发花”工序中产生的优势菌——冠突散囊菌，目前已被证实在降脂、减肥及抗肿瘤等方面有特殊作用，而其对免疫方面的影响尚未见报道，故茯砖茶中哪些活性成分具有提高免疫的作用有待研究。

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