12种百合属植物花粉形态扫描电镜观察

张彦妮，钱灿

（东北林业大学园林学院，黑龙江 哈尔滨150040）

花粉是植物携带遗传信息的雄性生殖细胞，其形态具有较强的遗传保守性［1］。且种类不同，花粉活力和数量变化范围较大［1，2］。在世代相传过程中，花粉基本上保持其固有形态特征，如形状、轮廓、纹饰、萌发孔的数目、位置和特征以及花粉壁结构，这些形态和结构特征是鉴别植物种的重要依据之一［3，4］。目前通过观察植物的花粉形态和外壁纹饰来探讨和研究它们在植物分类学上的作用和意义的报道很多［5－13］。

百合科百合属植物是世界上重要的鲜、切花卉，具有较高的观赏、药用和食用价值。我国是百合自然分布中心，了解百合的花粉生物学特性不仅是杂交育种的成功基础，也是种质资源鉴定的重要依据之一。对于百合属植物的花粉形态，国内学者曾经开展过一些研究［14］。早在1989年，孙启时和石猛［15］就对10种东北百合属植物的花粉形态进行了光学显微镜和扫描电镜观察，但他们仅仅做了最为基本的形态描述没有进行更为深入的探讨和分析。李景奇等［16］对百合属9种植物花粉的形态特征进行了光学显微镜和扫描电镜观察，结果表明百合属花粉形状为较一致的椭球形，首次发现湖北百合（Liliumhenryi）存在单双基柱网纹，并以花粉外壁纹饰特征制出种的检索表。张西丽［17］观察了9种百合花粉的电镜扫描结果，依据形态特征的聚类分析将9种百合划分为3大类群系（亚洲系、东方系和麝香系）。刘英等［18］对5种荷兰百合的花粉形态进行了电镜观察，发现3种百合具有多个基粒重合现象，但其所用百合品种较少，有些特征可能不具有广泛性。曾小英等［19］对兰州地区的几种百合花粉进行了扫描电镜研究，结果表明网眼形态好，网脊排序一致性较高，其他特征品系间差异显著。张丽娜等［20］报道了13种百合花粉的电镜扫描观察结果，他们观察的花粉大小、网脊和网眼大小与以前的研究有一定差异，并将其归因于实验方法和花粉材料不同造成的。吴祝华等［21］对18种百合花粉的形态进行了观察和比较，并对花粉特征的聚类分析和进化关系进行了探讨，其进行的分析和讨论较为深入，但主要基于南方地区的百合品种展开分析缺乏对东北地区的野生百合花粉特征比较。最近，张延龙等［22］报道了秦巴山地8种野生百合的花粉形态特征，结果发现不同百合种在花粉形态、大小、P／E值及纹饰等方面存在较大差异。国外对百合花粉形态报道较少，Halbritter［23］报道了Liliummartagon的花粉为单粒、扁球形、赤道面为椭圆形，有单沟，半不连续覆盖层，网状纹饰。Jones等［24］发现L.michauxii的花粉形态与L.martagon相似。

上述分析表明不同学者虽然开展了一些百合花粉电镜观察研究，但多数是基于南方地区的一些耐热品种，在哈尔滨地区栽植抗寒性强的种或品种相对较少。本研究选取了在哈尔滨地区栽植的4种野生百合和8种栽培百合的花粉进行扫描电镜观察和形态特征比较，旨在增加百合花粉电镜观察的品系，同时为鉴定各种和品种之间的亲缘关系、系统学及起源与演化研究提供基本数据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验的百合花粉来源于4个野生种：细叶百合（Liliumpumilum，简称 W1）、兰州百合（LiLumdavidi，简称 W2）、卷丹（Liliumlancifolium，简称 W3）、大花卷丹（Liliumleichtliniivar.maximowiczii，简称 W4）；8个百合栽培品种：‘布鲁赛尔’（Brunello，简称 A1）、‘普瑞头’（Prato，简称 A2）、‘多安娜’（Pollyanna，简称 A3）、‘红骑士’（Red knight，简称 A4）、‘阿尔格夫’（Algarve，简称 O1）、‘耶罗林’（Yelloween，简称 O2）、‘萨莫’（Samur，简称O3）、‘西伯利亚’（Siberia，简称O4）。这些材料均栽种于东北林业大学园林学院花卉研究所苗圃实验地内。

1.2 方法

2009年6月－2009年7月下旬，从饱满的尚未开放的花蕾中直接取出花药（每种重复3次，每次重复选取4个不同单株上的花朵），置于培养皿中，自然干燥后分别包装，做好品种标记，放入干燥皿中于低温冰箱中保存备用。用pH＝6.8的戊二醛固定，并置于4℃冰箱中固定1.5h。用0.1mol／L，pH＝6.8的磷酸缓冲液冲洗3次，每次10min。分别用浓度为50%，70%，80%，90%的乙醇进行脱水，每次10～15min；再用100%乙醇脱水3次，每次10～15min。将材料置于100%的乙醇∶叔丁醇＝1∶1和纯叔丁醇中各浸泡1次，每次15min。用ES－2030（HITACHI）型冷冻干燥仪对样品进行4h干燥处理。将样品观察面向上，用导电胶带粘在扫描电镜样品台上。用E－1010（HITACHI）型离子溅射镀膜仪在样品表面镀上一层15nm厚的金属银膜。将处理好的样品放入样品盒中进行扫描观察远极面、近极面和局部的外壁纹饰，网眼大小和网脊宽度是在扫描电镜照片上各随机测量20个数值，然后求得平均值。同时拍照。

1.3 计算方法

花粉大小的测量和统计数均为20粒。取最小、最大和平均3种值表示变化幅度。花粉粒大小以极轴长和赤道轴长（P×E）来表示，极轴长和赤道轴长比（P／E）值表示花粉粒的形状，P／E＞1.6为长椭球形，P／E在1.3～1.6为椭球形。表面纹饰、网脊、网眼等花粉形态特征用Punt等［25］文章中的专业术语来描述。用扫描电镜测量出的百合花粉定量特征（极轴长、赤道轴长、网脊宽度和网眼大小的最小、最大、平均值以及极轴赤道轴长比）聚类以判断12种百合之间的大致亲缘关系，聚类分析用Statistica完成。

2 结果与分析

2.1 花粉大小和形态结构

观察结果表明（表1），12种百合属植物的花粉为椭球形或长椭球形。从花粉大小来看，不同种或品种其花粉粒大小差异较大。细叶百合的花粉粒最小，兰州百合花粉粒次之；‘普瑞头’和‘多安娜’的花粉粒相对较大。花粉粒的大小与花的大小有一定的关系，结合试验材料的品质特征调查结果，发现花粉粒大的类型其花朵也大，细叶百合和兰州百合花朵的冠幅分别平均为6.2和6.5cm，‘普瑞头’和‘多安娜’花朵的冠幅分别平均为15.6和15.2cm，这可能与自身遗传物质以及品种筛选时以观花为主要目的有关。

从花粉粒形状来看，东方百合的4个品种花粉粒均呈长椭球形，4种野生百合和亚洲百合的栽培品种的花粉粒均为椭球形。对试验材料进行品质特征调查时发现，东方百合品种抗寒性差，野生种百合和亚洲百合品种具有很强的抗寒性，由此分析，P／E与抗寒性呈负相关关系。从网脊宽度来看，‘西伯利亚’的网脊宽度最大，与其他种和品种差别较大；‘萨莫’次之，其表面的网脊较大，‘红骑士’和 ‘耶落林’的网脊相对较小。此外，百合属花粉粒均以单粒形式存在，赤道面观呈舟形，具单萌发沟且沟延伸近两级。这与张丽娜等［20］的研究结果相一致。花粉表面均分布有大小、疏密不等的空穴。

2.2 花粉外壁纹饰和萌发器官

从花粉外壁纹饰来看，12种百合属植物花粉的外壁均呈网状，网脊颗粒状或不规则，形成圆形、椭圆形或不规则网眼。网眼的大小、分布密度及形态特征在种或品种间有一定的差异（图1～12）。有些种类网眼较大（如西伯利亚），有些种类网眼较小（如兰州百合）。所有种类的萌发孔均为单沟萌发孔，萌发沟宽窄、深浅不等，有的种类的萌发沟上有明显的表面纹饰（如多安娜），有的沟内有颗粒状突起（如兰州百合）。

细叶百合花粉表面纹饰为单基柱网纹，网脊由大小不一、排列紧密的盘珠状颗粒组成。网眼大小不均一，网眼内无颗粒状突起，网脊顶端宽、厚不等；单孔沟较深，沟延伸近两极，宽窄不等（图1）。

表1 12种百合花粉电镜扫描形态特征比较Table 1 Comparison of pollen morphology for 12lily species under the scanning electron microscope observation

图1 细叶百合花粉粒形态Fig.1 Pollen morphology of L.pumilum

兰州百合花粉表面纹饰为单基柱网纹，偶见于网眼连接处网脊颗粒紧密聚集，网眼内有刺状突起。网脊由大小不等、排列紧密的盘珠状颗粒组成。网眼不规则，大小不等。单孔沟宽且浅，沟延伸近两极，孔沟内有颗粒状突起（图2）。

卷丹百合花粉表面纹饰为单基柱网纹，偶于网眼连接处具基粒重合现象。网脊由大小较均一、排列紧密的盘珠状颗粒组成。网眼大小不等。网眼内有颗粒状突起。网眼形状多样。单孔沟宽，沟延伸近两极，深浅不一。孔沟内有颗粒状突起（图3）。

大花卷丹花粉表面纹饰为单、双排基柱并存的网纹，网脊由大小较均一、排列紧密的瘤状颗粒组成。单萌发沟，宽且浅，延伸达两极。萌发沟内见少量网状纹饰。网孔内见颗粒状突起（图4）。

‘布鲁赛尔’百合花粉表面纹饰为单基柱网纹，网脊由大小均一、排列较紧密的盘珠状颗粒组成。网脊较宽，网眼较小，大小不等。单萌发沟，宽且浅，延伸近达两极，边缘规整（图5）。

图2 兰州百合花粉粒形态Fig.2 Pollen morphology of L.davidi

图3 卷丹百合花粉粒形态Fig.3 Pollen morphology of L.lancifolium

图4 大花卷丹花粉粒形态Fig.4 Pollen morphology of L.leichtlinii var.maximowiczii

图5 ‘布鲁赛尔’花粉粒形态Fig.5 Pollen morphology of‘Brunello’

‘普瑞头’百合花粉表面纹饰为单基柱网纹，网脊由大小不一、排列疏松的瘤状颗粒组成。网眼较大。单萌发沟，宽且浅，延伸达两极，沟上有明显的表面纹饰，网纹与花粉其他部位相同（图6）。

‘多安娜’百合花粉表面纹饰为单基柱网纹，网脊由大小较均一、排列疏松的瘤状颗粒组成，网脊不平滑，较宽。网眼较小，不规则，连接处有颗粒重叠现象。单萌发沟，宽且浅，延伸达两极，沟上有明显的表面纹饰，网纹与花粉其他部位相同（图7）。

‘红骑士’百合花粉表面纹饰为单基柱网纹，网眼内有刺状突起。网脊由大小均一、排列紧密的瘤状颗粒组成，较窄。网眼为不规则形，较小。单萌发沟，宽且浅，延伸达两极，沟内有颗粒状突起（图8）。

‘阿尔格夫’百合花粉表面纹饰为单基柱网纹，网眼内有瘤状突起。网脊由大小均一、排列紧密的盘珠状颗粒组成，网脊较宽。网眼大。单萌发沟，宽且较深（图9）。

‘耶罗林’百合花粉表面纹饰为单基柱网纹，偶于网眼连接处具基粒重叠现象。网脊由大小较均一、排列疏松的瘤状颗粒组成。网脊较窄，网眼小。花粉萌发沟窄且深陷（图10）。

图6 ‘普瑞头’花粉粒形态Fig.6 Pollen morphology of‘Prato’

图7 ‘多安娜’花粉粒形态Fig.7 Pollen morphology of‘Pollyanna’

图8 ‘红骑士’花粉粒形态Fig.8 Pollen morphology of‘Red knight’

图9 ‘阿尔格夫’花粉粒形态Fig.9 Pollen morphology of‘Algarve’

图10 ‘耶罗林’花粉粒形态Fig.10 Pollen morphology of‘Yelloween’

‘萨莫’百合花粉表面纹饰为单基柱网纹，偶于网眼连接处具基粒重叠现象，网眼内有瘤状突起。网脊由大小均一、排列较紧密的盘珠状颗粒组成。网眼大小不一。单萌发沟，较宽，宽窄比较均匀，沟延伸达至两级（图11）。

‘西伯利亚’百合花粉表面纹饰为单基柱网纹，网脊由大小不一、排列疏松的瘤状颗粒组成。偶有基柱断裂现象。网脊较宽，网眼很大，网眼内有颗粒状突起。花粉萌发沟凹陷（图12）。

图11 ‘萨莫’花粉粒形态Fig.11 Pollen morphology of‘Samur’

图12 ‘西伯利亚’花粉粒形态Fig.12 Pollen morphology of‘Siberia’

2.3 亲缘关系

12种百合花粉数量特征聚类分析显示（图13），如果以连接距离18来划分，12种百合大致可以分为3类，细叶百合、兰州百合、‘红骑士’和‘耶罗林’较为相似聚为一类，其中细叶百合和兰州百合亲缘关系更近；卷丹、大花卷丹、‘布鲁赛尔’、‘阿尔格夫’、‘萨莫’和‘西伯利亚’较为相似聚为一类，其中卷丹、大花卷丹亲缘较近，‘阿尔格夫’和‘萨莫’亲缘关系也较近；最后，‘普瑞头’和‘多安娜’花粉形态数字特征较为接近聚为一类，而且这2个品种从数量特征上来看距其他种亲缘关系较远。

通过百合花粉形态的数量特征聚类分析可以大致地反映不同种及品系之间的亲缘关系，特别是对数字形态较为相似的品种较为准确。但由于聚类分析中没有考虑百合花粉的定性特征，比如纹饰、网脊排列、网眼内突起等以及萌发器官等描述特征，因此不能完全以此来判定种间亲缘关系，还必须借助其他性状综合判定更为准确。

图13 12种百合花粉数量特征聚类分析Fig.13 Cluster analysis of quantitative pollen status for 12lily species

3 结论与讨论

根据12个百合种或品种的花粉特征，本实验中观察的百合花粉粒均以单粒形式存在，对称性较强，花粉粒呈椭球体或长椭球体，极面观为椭球体，边缘处具一凹陷，赤道面观为舟形，单沟萌发孔，沟长达两端，网眼为不规则多边形至近圆形，大小不一。孙启时和石猛［15］发现东北地区的卷丹和大花卷丹花粉粒较大，极轴长为100～130 μm，赤道轴长为60～75μm，张丽娜等［20］所得到的结果与他们类似，但本实验中这2个品种的花粉粒比他们的测量值要小，与张延龙等［22］研究结果类似；细叶百合、兰州百合花粉粒特征与张丽娜等［20］的结果相比也都偏小，但与曾小英等［19］的研究结果类似。张延龙等［22］认为花粉粒大小可能与植物生长环境有关系，因此推论花粉形态可能比花粉绝对大小更加稳定。另外花粉粒的大小还可能与花粉采集时间、实验处理及测量仪器设备有关。实验结果分析表明，花粉的P／E值与抗寒性呈负相关关系。Wodehouse［26］认为，越进化的花粉其调节功能越强，而调节功能随着花粉体积与表面积之比的减少而增强，体积与表面积之比与花粉的长度呈反比，即花粉越长，其体积与表面积之比就越小，调节功能越强，也就越进化。

百合属植物花粉形态存在多样性。从表面纹饰来看，12个百合种中的细叶百合、‘布鲁赛尔’、‘普瑞头’、‘多安娜’、‘红骑士’、‘阿尔格夫’、‘西伯利亚’的花粉表面纹饰为单排基柱网纹，而兰州百合、卷丹、‘耶罗林’、‘萨莫’花粉粒表面为单基柱网纹，偶见网眼连接处网脊颗粒紧密聚集重合。大花卷丹为单、双基柱共存网纹。前人分析得出百合属植物的纹饰演化路线为，拟网纹→双排基柱网纹→单、双排基柱网纹→单排基柱或网眼连接处具基粒重合网纹→单排基柱网纹［27］。由此分析得出，百合不同种或品种网纹间的差异和进化关系有关，细叶百合、‘布鲁赛尔’、‘普瑞头’、‘多安娜’、‘红骑士’、‘阿尔格夫’、‘西伯利亚’比兰州百合、卷丹、‘耶罗林’、‘萨莫’、大花卷丹要进化，这与P／E值的分析有一定差异，可能是由于百合栽培品种或变种的遗传背景较复杂，进化关系难以从单一性状指标看出，这与吴祝华等［21］得出的结论相一致。从萌发沟情况来看，12个百合种或品种均为单萌发沟，有所不同的是，‘耶罗林’和‘西伯利亚’花粉的萌发沟有不同程度的凹陷，曾小英等［19］报道过‘西伯利亚’花粉扫描电镜特征，但并未提到萌发沟有凹陷的问题。亚洲百合品种‘普瑞头’和‘多安娜’花粉萌发沟上有明显的表面纹饰，此现象并未在相关文章中报道过，其原因有待于进一步研究。

从网眼和网脊来看，百合品种‘阿尔格夫’、‘萨莫’、‘西伯利亚’花粉粒网眼大，分别为6.55，6.95和7.66 μm。其他百合种或品种的网眼较小，网眼大小为2.11～3.57μm。百合品种‘普瑞头’和‘多安娜’、‘耶罗林’和‘西伯利亚’以及卷丹百合网脊颗粒排列疏松，其他百合种或品种网脊颗粒排列紧密，网眼和网脊之间的差异并无明显的规律，但是各个种或品种都有自己独有的特点，可以作为种的鉴定依据。

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