脑缺血-再灌注动物模型的改良与评价

杨德兵 马存根 尉杰忠

（山西大同大学脑科学研究所，山西 大同 037009）

研究人类脑缺血、缺氧性疾病的动物模型有多种，近年大鼠大脑中动脉阻断-再通模型是应用较多的脑缺血-再灌注模型。传统的大鼠大脑中动脉缺血-再灌注方法，是由颈外动脉插线转入颈内动脉，操作复杂,成功率较低；笔者改良了建模方法,直接结扎并由颈总动脉插线，而由颈外动脉依靠侧枝循环恢复血供，使得造模更简便有效。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

Wistar大鼠 50只，雄性，体质量 260～300g，购自山西医科大学实验动物中心。将大鼠随机分为3组：传统方法缺血-再灌注组 20只，改良方法缺血-再灌注组 20只，另设假手术（对照）组 10 只。

1.2 试剂

分析纯 TTC 由武汉博士德生物工程有限公司提供，用于脑组织的大体染色；其他常规试剂由山西大同大学脑科学研究所提供，均为分析纯。

1.3 设备

鼠兔两用恒温手术台、体视显微镜、轮转式切片机、手术显微镜、BI2000医学图像分析系统等，均由山西大同大学脑科学研究所及形态实验室提供。

1.4 方法

1.4.1 渔线处理

将 0.6 规格渔线剪为 5 cm 长，将其一端在酒精灯上稍微烧结，于体视显微镜下挑选出烧结满意即稍膨大而光滑无刺者，用中性炭素笔在距烧结端 2cm 处划一标记，最后置于 1000U/mL肝素中浸泡冷藏。

1.4.2 手术方法

1.4.2.1 假手术组

3%戊巴比妥钠腹腔麻醉动物，作颈部正中矢状切口，分离右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，以温湿盐水纱布覆盖创口 2h后缝合切口。

1.4.2.2 传统手术组

在假手术组基础上，寻找并结扎右侧翼腭动脉，结扎颈外动脉远端，然后自颈外动脉将渔线烧结端插入，牵拉颈外动脉近侧端大致与颈内动脉于一直线，将渔线送入颈内动脉，缓慢插入，感觉到有阻力为止，用活结将颈外动脉连同渔线一并结扎，缺血2h，放松结线，将渔线拨出，再结扎颈外动脉，缝合皮肤切口，再灌注24h。

1.4.2.3 改良手术组

将大鼠麻醉，作颈部正中作矢状切口，分离出颈总动脉、颈内动脉、部分颈外动脉，永久结扎颈总动脉近侧。约在距颈总动脉末端2mm 处剪开小口，插入渔线烧结端，直行送入颈内动脉，入颅后，感觉有阻力为止，说明渔线已达到大脑中动脉起始部，将渔线、颈总动脉用活结一并结扎，缺血2h，放松结线将渔线拔出，再将颈总动脉远端永久结扎，依靠颈外动脉的侧支循环逆行入颈内动脉恢复大脑中动脉缺血区的供血，再灌注24h。在插线过程中，为减少出血，可暂时结扎或钳夹颈外动脉，插线完成后即放开。

手术中还可辅以手术显微镜，以减少插线困难。

1.4.3 实验动物缺血成功与否判定

动物麻醉苏醒后，若出现缺血侧的 Horner 综合征和（或）对侧以前肢为主的偏瘫，或者因插线致脑缺血死亡，则为缺血成功。

1.4.4 缺血-再灌注动物行为学评价

再灌注24h后，采用Tatlisumak[1]等创建的方法对大鼠行为障碍进行评分：活动正常，无神经功能缺失，记0分；右侧前爪不能完全伸展，记1分；爬行时出现向右侧转圈，即追尾征，记2分；行走时身体向右侧倾倒，记3分；意识丧失，不能行走，记4分。

1.4.5 脑组织染色

各组大鼠于术毕（对照组）或恢复再灌（常规手术组、改良手术组）后 24h 时点，经戊巴比妥过量麻醉，沿中线切开腹前壁，再向上打开胸腔，剪开右心房，自左心室灌注 4℃ 0.02 PBS，至肝脏变白。沿颅顶矢状切开皮肤达骨，钳掉颅盖，取出脑干以上脑部，置 0℃0.02 PBS中硬化 5min。然后将低位脑干及嗅脑切掉，再冠状位均匀切为 2mm 厚薄片（多数可切7片），作TTC染色材料。

TTC的配制及染色参照Chintamani[2]进行，免疫组织化学染色按照试剂盒要求逐步进行。

2 结 果

3.1 缺血成功率比较

各组脑缺血结果见表1。

表1 大鼠脑缺血-再灌注成功率比较

评价结果，传统手术组、改良手术组成功率分别为 0.65，0.95，作χ2检验，P= 0.02，差异具有显著性；但在缺血成功且成活、缺血成功但死亡、缺血未成功而成活、缺血未成功而死亡等方面，未发现显著差异。

2.2 大鼠行为学评分比较

排除手术过程中死亡大鼠外，对大鼠进行行为学测试，结果见表2。

表2 大鼠行为学评分比较

2.3 TTC染色结果及评价

经TTC染色，缺血脑组织不着色，而非缺血区则染为粉红或紫红色。结果显示，对照组脑切片无缺血区，成功的传统手术组及改良手术组均有不同体积缺血区，且有改良组＝传统组的趋势，但数据缺乏统计学意义。

3 讨 论

3.1 关于大鼠脑缺血-再灌注损伤

大鼠脑缺血2h后恢复再灌注，与人类缺血缺氧性脑损伤的过程比较接近，并可形成稳定的梗死灶，且缺血成功的大鼠在再灌注后24h出现行为学严重损伤。张荣媛等[3]发现，大鼠在大脑中动脉缺血-再灌注4h后行为学损伤表现最为严重，随再灌注时间延长，会有所恢复，但128h后不再恢复，说明缺血-再灌注损伤不是完全可逆的。我们的观察结果支持再灌注能部分减轻缺血所造成的损伤。

3.2 模型制备方法的改良

两组动物在缺血成功率上有显著差异，纠其原因主要是由于两组在操作难度上的差异造成的。传统手术组插线难度要大得多，经常导致出血过多、颈外动脉断裂等问题，且操作时间明显较长，而改良方法的操作则要简单得多。虽未发现两组动物在未成功而死亡方面的显著差异，但传统手术组死亡数量明显较多，我们估计，增加样本含量后，应会显示出差异的显著性。

3.2.1 线栓的走行

传统方法是将线栓由颈外动脉插入经颈总动脉分叉处转入颈内动脉，主要存在2个困难：一是颈外动脉较细，插线不容易进行，且容易导致动脉断裂而使得插线更加困难；二是由颈外动脉将插线转入颈内动脉时对角度要求比较高。而在我们的改良方法中，则是将线栓由颈总动脉末端附近插入，再进入颈内动脉。从解剖学角度来说，颈内动脉相当于颈总动脉的直接延续，所以线栓走行路径顺畅，插线多能顺利进行。实验中将颈总动脉永久结扎，这就更保证了大鼠的脑缺血；而双侧颈外动脉之间的广泛吻合，能保证再灌注的进行。在双侧颈外动脉吻合之间的研究也较多，不同种属之间存在较大差异，所以合理选择实验动物的种属，对改良方法成功与否影响较大。

3.2.2 小动脉的处理

大鼠翼腭动脉比较粗大，在传统方法中，由于线栓进入角度问题，常可误入该动脉，故而需要结扎翼腭动脉；在我们的改良方法中，线栓方向与颈内动脉平行，走行顺利，不需要结扎翼腭动脉。这就带来了明显的好处：一是手术时间明显缩短；二是减少了寻找、结扎该动脉时导致的血管损伤及出血；第三，减少了由于结扎翼腭动脉所导致的颈内动脉血栓形成概率，使再灌注后能较快恢复血液供应。

3.3 模型的行为学评价

局灶性脑缺血神经系统症状主要表现为缺血对侧的肢体功能障碍。国际上常以神经症状评分作为通用的评判标准，评分方法较多，有 Bederson法[4]、Nagaoka法[5]、zea- Longa法[6]、Tatlisumak法[7]、Hattori法[8]等，并证实了行为学评分与脑梗死体积间具有相关性。国内学者张荣媛等提出了更详细的综合评价法，包括了对缺血动物神经功能的评分及对前庭功能的评分，使得评价更为精细合理。本实验仍采用Tatlisumak提出的4分法进行评价。

[1]杨家斐,余新光,周定标,等.亚低温预处理大鼠局灶性脑缺血的保护作用[J].军医进修学院学报,2003,24 (3) : 217-218.

[2]Schumacher H,Kaiser E,Schnabel PA,et al.Immunophenotypic characterization of carotid plaque: increased amount of inflammatory cells as an independent predictor for inschemic symptoms[J].Eur J Vasc Endovasc Surg,2001,21(6):494-501.

[3]张荣媛,张宏伟,尚爱加.大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型制备及行为学评价标准的改进[J].军医进修学院学报,2008,29 ( 5) :422–423.

[4]Bederson JB,Pitts LH,Tsuji M,et al.Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke,1986,17(3): 472-476.

[5]Nagaoka A ,Suno M,Shi bota M,et al.Effects of idebenone( CV-2619) on neurological deficits,local cerebral blood flow,and energy metabolism in rats with experimental cerebral ischemia[J].Nippon Yakurigaku Zasshi,1984,84 (3): 303-309.

[6]Zea-longa E,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middleartery artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[7]Tatlisumak T,Takano K,Carano RA.Delayed treatment with an adenosine kinase inhibitor,GP683,attenuates infarct size in rats with temporary middle cerebral artery occlusion[J].Stroke,1998,29(9):1952-1958.

[8]Hattori K,Lee H,Hum PD,et al.Cognitive deficits after focal cerebral ischemia in mice[J].Stroke,2000,31(8): 1939-1944.