苦参碱对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜细胞因子和自由基的影响

钟振东，熊永爱，杨玲

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种自身免疫性的直肠、结肠的慢性炎性和溃疡性病变，属临床疑难病。主要表现为腹泻、腹痛、黏液血便等症状[1]。目前 UC 病因与机制尚不十分明确，但已明确免疫反应异常，细胞因子分泌失衡是其发病中的重要环节[2]。IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α是公认能介导 UC 发病的细胞因子，UC 活动期IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α 的分泌量与病变程度成正相关[3]。

自由基对结肠黏膜细胞损伤也是溃疡性结肠炎发病的重要机制。当机体氧自由基产生过多，而抗氧化物质活性较低时，氧自由基在引起脂质氧化的同时，增加黏膜的通透性，使吞噬细胞活动进一步加强，产生更多的氧自由基，导致组织细胞的损伤[4]。

中药苦参能改变 UC 患者腹痛、腹泻等临床症状，是临床上治疗 UC 常用中药之一[5]。苦参碱是从苦参中提取的有效成分，现代研究证明，苦参碱能抑制炎症介质释放，抗炎作用与氢化可的松相似，但没有氢化可的松的毒副反应。苦参碱能降低毛细血管通透性，抑制肉芽组织增生。此外，还能对抗自由基氧化对细胞导致的损伤，抑制纤维生成等作用[6]。但目前关于苦参碱对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜细胞因子和自由基的影响尚无报道，本研究通过苦参碱对 TNBS 诱导大鼠溃疡性结肠炎治疗，探讨苦参碱对实验性溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜细胞因子和自由基的影响，进而研究苦参碱干预UC 机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性 SD 大鼠 60 只，8～12 周龄，体重 180～220 g，购自成都达硕生物科技有限公司，合格证号 scxk（川）2008-24，饲养于 IVC 级动物房。

1.1.2 药品和试剂 苦参碱由四川省农业科学院提供。三硝基苯磺酸（TNBS）（批号:107K5008）购自美国 Sigma 公司；IL-1β（批号：E10J0402）、TNF-α（批号：E10J0403）、IL-6（批号：E10J0404）、IL-8（批号：E10J0405）试剂盒由成都杰纳生物科技有限公司提供；SOD（批号：20101015）和 MDA（批号：20101112）试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及 UC 模型复制 SD 大鼠适应1 周饲养后，随机分成 4 组，每组 15 只动物。禁食 24 h 后，除正常组外，其他组按 3 ml/kg 体重腹腔注射 20%乌拉坦溶液麻醉。将一直径约2mm，长约 12cm 的橡胶输液管由肛门轻缓插入，深度为8cm，注入 2%TNBS 溶液 100 mg/kg 体重，让大鼠保持平躺，自然清醒[7]。

1.2.2 给药方案 正常组和 UC 模型组灌胃给予等剂量生理盐水；阳性对照组，按 600 mg/kg 体重灌胃给予柳氮磺胺吡啶溶液；苦参碱组，按180 mg/kg 体重灌胃给予苦参碱溶液。

1.2.3 IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β、SOD 和 MDA测定 第21 天处死大鼠，取长度约 0.4cm 的结肠匀浆，300×g离心 10min，取上清液分装，–20℃保存，按试剂盒说明书方法检测。

1.2.4 光镜检查 剪取结肠病变最明显处 2cm放于 10%中性缓冲甲醛溶液中固定，酒精脱水，石蜡包埋，切片厚度 4～6 μm，HE 染色，置 100 倍光学显微镜下观察。

1.3 统计学方法

采用 SPSS 软件进行统计，组间数据采用对照t检验，以±s表示，以P＜0.05 为统计结果有显著差异，以P＜0.01 为统计结果有极显著差异。

2 结果

2.1 苦参碱对结肠细胞内 IL-1β 和 TNF-α 的影响

与模型组相比，给药组结肠组织 IL-1β 水平均极显著降低（P＜0.01），表明柳氮磺胺吡啶和苦参碱均能下调炎性细胞分泌 IL-1β；给药组结肠组织TNF-α 水平均显著降低（P＜0.01），表明两组药物能下调炎性细胞分泌 TNF-α 水平（表1）。

表1 IL-1β 和 TNF-α 水平测定结果（±s ，n = 10）Table 1 The testing results of IL-1β and TNF-α in colon tissues (±s , n = 10)

表1 IL-1β 和 TNF-α 水平测定结果（±s ，n = 10）Table 1 The testing results of IL-1β and TNF-α in colon tissues (±s , n = 10)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与柳氮磺胺吡啶比较，△P＜0.05，△△P＜0.01Notes: *P＜0.05, **P＜0.01 vs model; △P＜0.05, △△P＜0.01 vs SAPA.

组别 Groups IL-1β（pg/mg） TNF-α（pg/mg）正常组 Normal group 60.00±9.97**△△ 61.44±18.77**△△模型组 Model group 627.14±209.04△△ 109.33±35.49阳性组 SASP group 133.30±39.39**△ 77.56±13.05**苦参碱组 Matrine group 268.89±102.50** 84.88±12.56*

2.2 苦参碱对结肠细胞中 IL-6、IL-8 的影响

与正常组比较，模型组大鼠结肠组织中 IL-6、IL-8 水平均极显著性升高（P＜0.01），表明结肠组织局部免疫细胞分泌促炎因子十分活跃。与模型组相比，苦参碱组、柳氮磺胺吡啶组结肠组织中 IL-6水平均显著降低，苦参碱组具有极显著性（P＜0.01），表明苦参碱和柳氮磺胺吡啶都能下调结肠组织异常升高的 IL-6 水平。与模型组相比，苦参碱组、柳氮磺胺吡啶组均能显著降低结肠组织中 IL-8水平（P＜0.01）（表2）。

表2 结肠组织中 IL-6、IL-8 水平测定结果（±s ，n = 10）Table 2 The testing results of IL-6 and IL-8 in colon tissues (±s , n = 10)

表2 结肠组织中 IL-6、IL-8 水平测定结果（±s ，n = 10）Table 2 The testing results of IL-6 and IL-8 in colon tissues (±s , n = 10)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与柳氮磺胺吡啶组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01Notes: *P＜0.05, **P＜0.01 vs Model; △P＜0.05, △△P＜0.01 vs SAPA.

组别 Groups IL-6（pg/mg） IL-8（pg/mg）正常组 Normal group 8.91±2.36**△ 164.68±55.37**模型组 Model group 14.27±5.46 297.00±94.97△阳性组 SASP group 9.82±2.17* 199.25±62.69**159.86±24.55**△苦参碱组 Matrine group 8.81±1.69**△

2.3 苦参碱对结肠细胞中 SOD、MDA 的影响

与正常组比较，模型组大鼠结肠组织中 SOD极显著性降低，MDA 水平极显著性升高（P＜0.01），表明结肠组织局部自由基系统处于失衡状态。与模型组相比，苦参碱组、柳氮磺胺吡啶组结肠组织中 SOD 水平极显著性升高（P＜0.01），说明苦参碱能明显上调结肠组织异常降低的 SOD水平。与模型组相比，苦参碱组、柳氮磺胺吡啶组结肠组织中 MDA 水平均极显著降低（P＜0.01），说明苦参碱能明显下调结肠组织异常升高的MDA 水平（表3）。

表3 大鼠结肠组织 SOD、MDA 水平测定结果（±s ，n = 10）Table 3 The testing results of SOD and MDA in colon tissues (±s , n = 10)

表3 大鼠结肠组织 SOD、MDA 水平测定结果（±s ，n = 10）Table 3 The testing results of SOD and MDA in colon tissues (±s , n = 10)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与柳氮磺胺吡啶组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01Notes: *P＜0.05, **P＜0.01 vs model; △P＜0.05, △△P＜0.01 vs SAPA.

组别 GroupsSOD（U/mg） MDA（pg/mg）正常组 Normal group 38.93±9.34**△△ 0.94±0.23**模型组 Model group 17.61±4.45 2.89±1.47△△阳性组 SASP group 30.88±6.60**△△ 1.15±0.14**苦参碱组 Matrine group 28.72±7.75 **△ 1.51±0.44**

2.4 光镜观察

模型组镜下可见溃疡，病变主要在黏膜下层，组织水肿明显，大量炎性细胞浸润，以淋巴滤泡增生为主（图1A 和 B）。苦参碱组和柳氮磺胺吡啶组溃疡较少并可见已愈合的溃疡组织，组织水肿和充血明显减轻，炎细胞浸润明显减少，（图1C 和D）。图1E 为正常组。镜检评分结果见表4。

图1 各组结肠病理切片 100×Figure 1 Pathology pictures of each group 100×

表5 结肠显微镜检查评分（±s ，n = 10）Table 5 The microscopy scores of colon tissues(±s ，n = 10)

表5 结肠显微镜检查评分（±s ，n = 10）Table 5 The microscopy scores of colon tissues(±s ，n = 10)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01Note: *P＜0.05, **P＜0.01 vs model

组别 Groups 镜检评分 Microscopy scores正常组 Normal group 0.0000±0.0000**模型组 Model group 3.9161±1.5009阳性组 SASP group 2.1829±1.5888*苦参碱组 Matrine group 1.4822±2.4404**

3 讨论

本实验采用 TNBS 诱导大鼠产生溃疡性结肠炎模型，探讨了苦参碱对实验性溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜细胞因子和自由基的影响。TNBS 诱导的溃疡性结肠炎呈慢性变化，病程较长，各种炎症介质如 PGE2、TNB2、LTC4和 IL 等发生明显变化，MPO 含量增高，与人类溃疡性结肠炎相似[8]。

细胞因子在 UC 发病中的作用已得到公认，TNF-α 是目前已知的与炎症性肠病（IBD）发病关系最为密切的细胞因子。TNF-α 在 IBD 患者的血、粪便和肠组织中水平均有所增加，主要通过使中性粒细胞聚集、上调凝血酶原效应等参与 UC 的发病[9]。UC 发病过程中促炎因子 IL-1β、TNF-α、IL-6 和 IL-8 等细胞因子分泌旺盛，苦参碱可以明显降低黏膜细胞过表达的细胞因子水平，表明苦参碱抗溃疡性结肠炎与其调节细胞因子失衡有关。

氧自由基是促进炎症发生发展的重要因素，SOD 可加速清除炎症反应所产生的对结肠黏膜有损伤的大量超氧化物离子等自由基，增强组织细胞的抗氧化能力，显著地减轻结肠黏膜炎症，促进溃疡愈合[10]。UC 发生时，结肠黏膜组织中 SOD 含量明显下降，MDA 含量明显增高，本实验中苦参碱可显著升高 SOD 含量，降低 MDA 含量，说明苦参碱通过抑制氧自由基反应干预了 UC 发病过程，为临床应用提供了理论依据。

综上，苦参碱能明显抵抗溃疡性结肠炎炎性反应，对溃疡损伤有明显修复作用，通过调节肠黏膜细胞因子失衡和氧自由基的产生和抗氧化功能干预了 UC 发病过程，但其具体作用靶点和干预机制尚不明确，需进一步深入研究。

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