双向发酵对草乌中乌头碱类成分含量影响及菌质抗炎镇痛作用的初步研究

王身艳，余黎，蒋亚平，陈建伟

双向固体发酵技术是南京中医药大学药用菌与中药生物技术研究中心庄毅教授于 20 世纪 80年代创立的一种新型的中药发酵技术。它采用药用真菌发酵具有活性成分的中药，产生一系列复杂的生理活动和生化效应，无需将药用真菌与次级代谢产物分离，两者共同使用，协同发挥药效[1]。中药发酵的目的主要为了增强药效、发现新的治疗作用、减毒解毒、扩大用药品种等。如潘扬等[2]采用药用真菌对马钱子进行双向发酵，结果表明，和空白对照相比，士的宁、马钱子碱的含量均呈下降的趋势,而士的宁氮氧化物、马钱子碱氮氧化物有不同程度的增加，毒性明显降低，药效增强。鉴于草乌毒性大，临床效果好，笔者对草乌用药用真菌进行了双向固体发酵。

草乌（Radix aconiti kusnezoffii）为毛茛科植物北乌头（Aconitum kusnezoffiiReichb.）的干燥母根。草乌临床应用已有几千年的历史，多具祛风除湿、温中止痛之功效。草乌药材中主要含乌头碱、中乌头碱和次乌头碱等双酯型生物碱。其双酯型生物碱既是毒性成分，也是活性成分,但性质不稳定,遇水加热则容易水解成毒性较小的苯甲酰单酯型生物碱及亲水性氨基醇类乌头原碱。现在乌头的炮制方法过分强调解毒，而忽视乌头的功效特点。本实验通过双向固体发酵技术对草乌进行生物转化研究，以期达到去毒存（增）效的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器与试剂 岛津 LC-10AT HPLC系统、LC-10ATAB 双泵、SPD-10A 紫外检测器、ERC-3415 自动脱气机、AT-5300 OVEN 柱温箱均为日本岛津公司产品；METTLER AE240 电子天平为瑞士梅特勒-托利多集团产品；SYZ-550 型石英亚沸高纯水蒸馏器为江苏金坛国胜仪器厂产品；HH-6 型数显恒温水浴锅为江苏国华仪器厂产品；R-124 型抽滤泵为瑞士 BUCHI 公司产品。色谱纯乙腈为美国 TEDIA 公司产品；水为双蒸水；其他试剂为分析纯，均购自南京化学试剂有限公司；乌头碱标准品（批号：110720-200410）、中乌头碱标准品（批号：0799-9403）、次乌头碱（批号：0798-9403）均购自中国药品生物制品检定所。

1.1.2 “药性基质”的来源 草乌购自南京市药材公司，经南京中医药大学药学院王春根教授鉴定为毛茛科乌头属植物北乌头（Aconitum kusnezoffii Reichb.）的干燥母根。

1.1.3 真菌菌株的选择 根据以往双向固体发酵的经验，首选槐耳（Trametes robiniophilaMurr.）、灵芝[Ganoderma lucidum(Leyss.) Karst]等 10 个经过菌株鉴定的药用真菌（菌株代号分别为A、Q、V、D、E、F、H、SW、O①、い，由南京中医药大学药用菌与中药生物技术研究所保藏）作为在草乌“药性基质”上进行生长条件筛选试验的菌株。

1.1.4 实验动物 昆明种雄性小鼠 100 只，6～8 周龄，体重（20±2）g，购自南京中医药大学动物实验中心[合格证号：SYXK（苏）2007-0030]，饲养于南京中医药大学实验中心 SPF 级动物房。

1.2 方法

1.2.1 草乌“药性菌质”的培养 在一定的生物技术控制下，运用“固体双向发酵”技术，用槐耳、灵芝、红栓等真菌发酵草乌，根据真菌与基质组合的发酵情况，即菌株能否与草乌（药性基质）相适应而正常生长为指标，发酵后从“药性基质”中获得 11 个草乌的“药性菌质”样品，其中有 1 个为空白对照（未经发酵）样品。在菌丝体生长一段时间后，取出各真菌发酵后的“药性菌质”，低温干燥，即得。并计算菌质得率：菌质得率（%）= 药性菌质干重（g）/药性基质干重（g）×100%。

1.2.2 对照品溶液的配制 精密称定乌头碱、中乌头碱和次乌头碱分别为1.4 mg、3.1 mg、3.9 mg，用乙腈定容至 5 ml，放置冰箱保存，备用。

1.2.3 供试品溶液的配制 取样品粉末 1.0 g，精密称定，置 50 ml 具塞烧瓶中，加入适量氨试液润湿，再加入 20 ml 乙醚，静置 24 h，超声提取30min，滤过，40℃水浴挥干，滴加乙腈试液，定容至 2 ml。

1.2.4 HPLC 的测定条件 固定相：Akzo Nobel Kromasil C18色谱柱（4.6mm×250mm，5 μm）；流动相：A 为缓冲液（0.2%冰醋酸用三乙胺调节pH 至 6.20）；B 为乙腈。梯度洗脱，洗脱程序见表1。进样量：10 μl；流速：1.0 ml/min；检测波长：240 nm；柱温：30℃；分析时间 85min。

1.2.5 样品含量变化分析及乌头碱类化合物指纹图谱的建立 取不同真菌发酵的草乌药性菌质，按上述 HPLC 条件与方法测定样品中乌头碱、中乌头碱、次乌头碱的含量变化和乌头的指纹谱差异。

表1 梯度洗脱程序Table 1 The mode of gradient elution

1.2.6 各草乌菌质对昆明种小鼠镇痛作用 取体重 18～22 g 雄性小鼠 50 只，按体重随机分为5 组，每组 10 只，分别为发酵空白组、草乌 + O①组、草乌 + A 组、草乌 + V 组、草乌 + F 组，按生药计给药量均为6 g/kg。灌胃给药，每日一次，连续 3 d。末次给药后 1 h，每只小鼠腹腔注射0.6%冰醋酸 0.1 ml/10 g，观察记录注射后 15min内各组扭体发生次数（小鼠出现腹部肌肉反复收缩、拱背、臀部扭转和后肢伸展）。

1.2.7 各草乌菌质对昆明种小鼠抗炎作用 取健康昆明种雄性小鼠 60 只，体重 18～22 g，按体重随机分为6 组，每组 10 只，分别为正常对照组、发酵空白组、草乌 + O①组、草乌 + A 组、草乌 + V组、草乌 + F 组，按生药计给药量均为6 g/kg。灌胃给药，每日一次，连续 3 d。末次给药后 1 h，在每只小鼠右耳均匀涂二甲苯 0.05 ml 致炎。30min后，小鼠脱颈椎处死，剪下耳廓，用 8mm 打孔器取双侧对称处的耳片称重，以两片耳重量之差作为肿胀度。

图1 部分真菌在草乌药材上的生长情况Figure 1 The growth of different fungi on crude drug

表2 10 种菌株在 PDA 培养基和乌头基质上第30 天生长情况记录Table 2 Growth of ten strains on nutrient and medicinal medium

表3 草乌菌质得率情况Table 3 The yielding of fungi substance

图2 草乌发酵前后 HPLC 图谱Figure 2 HPLC chromatogram before and after fermentation

2 结果

2.1 菌丝体生长情况及乌头碱类的含量测定

在同一发酵条件下，槐耳、灵芝等 10 种真菌对以草乌生品为药性基质的发酵情况有所不同。根据真菌与基质组合双方的发酵情况，初步判定代号为A、D、E、F、H 等 10 种菌株与药材“药性基质”基本相适应，菌丝体能够正常生长发育，部分真菌菌株在草乌基质上的生长情况，见图1和表2。

2.2 草乌菌质得率情况

在同一发酵条件下，槐耳、灵芝等 10 种真菌对以草乌生品为药性基质发酵情况有所不同，菌丝体生长的好坏与发酵后药性菌质相对得率（%）呈负相关，即菌丝体生长较好者，药性菌质相对得率（%）低；生长较差者，菌质相对得率（%）高。结果见表3。

2.3 草乌的指纹图谱

草乌菌质的生物碱类成分的指纹图谱见图2所示。与发酵空白比较，菌株 A、H、V等真菌作用于草乌后，指纹谱中显示出有不同的新产生的或含量变化较大的未知成分。

2.4 草乌菌质对醋酸所致小鼠扭体反应的影响

由表4可知，与发酵空白组比较，草乌 + A组、草乌 + V 组对抑制化学刺激所致的小鼠疼痛反应有显著性差异（P＜0.05）。

表4 草乌发酵前后对醋酸所致小鼠扭体次数的影响（±s，n = 10）Table 4 Effects of body twisting respond induced by acetic acid in mice (±s, n = 10)

表4 草乌发酵前后对醋酸所致小鼠扭体次数的影响（±s，n = 10）Table 4 Effects of body twisting respond induced by acetic acid in mice (±s, n = 10)

注：*P＜0.05 vs发酵空白组Note: *P＜0.05 vs control group

组别Groups剂量（g/kg）Dose (g/kg)扭体次数Writhing times发酵空白组Control group 6 34.00±10.21草乌 + O①Radix aconiti kusnezoffii+ O①6 27.20±8.35草乌 + A Radix aconiti kusnezoffii+A 6 24.80±4.13*草乌 + V Radix aconiti kusnezoffii+V 6 24.00±4.99*草乌 + F Radix aconiti kusnezoffii+F 6 28.80±12.88

2.5 草乌菌质对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响

由表5 可知，与发酵空白组比较，各实验组对抑制化学刺激所致的炎症反应无差异。

表5 草乌发酵前后对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的抑制作用（±s ，n = 10）Table 5 Effects of mice ear edema induced by p-xylene (±s , n = 10)

表5 草乌发酵前后对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的抑制作用（±s ，n = 10）Table 5 Effects of mice ear edema induced by p-xylene (±s , n = 10)

组别Groups剂量（g/kg）Dose(g/kg)肿胀度（mg）Swelling degree(mg)发酵空白组Control group 6 13.90±6.21草乌 + O①Radix aconiti kusnezoffii+ O①6 18.70±8.54草乌 + A Radix aconiti kusnezoffii+A 6 16.00±7.48草乌 + V Radix aconiti kusnezoffii+V 6 16.78±3.70草乌 + F Radix aconiti kusnezoffii+F 6 13.70±6.27

3 讨论

草乌药材中乌头碱、中乌头碱和次乌头碱等双酯型生物碱是其主要的毒性成分，也是这类药材回阳救逆、温中止痛的主要活性成分。

通过上述实验分析，药用真菌双向固体发酵草乌，与发酵空白组比较，草乌 + A 组、草乌 + V 组对抑制化学刺激所致的小鼠疼痛反应有显著性差异（P＜0.05）。

本项研究通过双向固体发酵的方法为毒性强、疗效好的乌头类有毒中药的解毒进行了有益的尝试，也为其他有毒中药的解毒提供了一种新的途径。

志谢对南京中医药大学江苏省中药药效与安全性评价重点实验室方泰惠教授、喻斌老师在药效学实验方面的指导表示感谢。

[1]Zhuang Y.A new solid fermentation engineering (bidirectional)induced by medicinal fungus.Edible Fungi China, 2002, 21(4):3-6.(in Chinese)庄毅.药用真菌新型(双向型)固体发酵工程.中国食用菌, 2002,21(4):3-6.

[2]Pan Y, Zhang X, Jiang YP, et al.The content of strychnos alkaloids and to contrast the finger printing before and after two-way fermentation.J Nanjing Univ Chin Med, 2006, 22(6):362-365.(in Chinese)潘扬, 张弦, 蒋亚平, 等.双向发酵前后马钱子生物碱含量及其HPLC指纹谱的比较.南京中医药大学学报, 2006, 22(6):362-365.