利用珍贵橙色束丝放线菌ATCC 31565氨甲酰基化4,5-双氢-7-去氨甲酰基格尔德霉素

刘昕，李书芬，牛沂菲，贾长虹，武临专，王以光

格尔德霉素（geldanamycin，GDM）和安丝菌素（ansamitocin，ASM）分别是由吸水链霉菌（如streptomyces hygroscopicus17997）和珍贵橙色束丝放线菌（如actinosynnema pretiosumATCC 31565）产生的具有抗肿瘤活性的安莎类抗生素[1-2]。GDM 与 ASM 具有相同的生物合成机制：它们均以 3-氨基-5-羟基苯甲酸（AHBA）为特异性生物合成起始物，在 I 型聚酮合酶（PKS）作用下将 7 个二碳单位连接形成安莎链，在酰胺合酶的作用下将安莎链与AHBA 连接环化；再经过 PKS 后修饰过程，形成 GDM 或ASM[3-4]。但是，GDM 与 ASM 的生物合成 PKS 后修饰存在显著差异：GDM 的 PKS 后修饰包括羟基化、O-甲基化、氨甲酰化和氧化等，ASM 的 PKS 后修饰包括卤（氯）化、N-甲基化（或 N-糖基化[5]）、O-甲基化、酰化、环氧化和氨甲酰化（环化）等（图1）。相对于 GDM，ASM 的 PKS后修饰似乎更加复杂。如果参与 ASM 生物合成的 PKS 后修饰系统可对 GDM 生物合成中间产物（或 GDM 本身）发挥修饰作用，就可获得新的格尔德霉素衍生物，从而为抗肿瘤药物开发提供候选化合物。基于该设想，本文作者进行了初步的探索研究。

图1 ASM 与 GDM 具有相同的生物合成机制、不同的 PKS 后修饰示意图

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 珍贵橙色束丝放线菌 ATCC 31565，ASM 产生菌；吸水链霉菌 17997，GDM 产生菌；吸水链霉菌 17997gdmN（氨甲酰基转移酶基因）阻断变株，4,5-双氢-7-去氨甲酰基-7-羟基格尔德霉素（4,5-dihydro-7-descarbomoyl-7-hydroxygeldanamycin，CT-1-7）产生菌[6-7]；吸水链霉菌17997gdmP（细胞色素 P450 单氧化酶基因）基因阻断变株，4,5-双氢格尔德霉素（4,5-H2GDM）产生菌（同时产生少量 17-O-demethylreblastatin）[8-9]。上述菌株均为本实验室保存或构建。

1.1.2 试剂 GDM、CT-1-7、4,5-H2GDM 和 17-O-demethylreblastatin，由本实验室分别从吸水链霉菌 17997、吸水链霉菌 17997gdmN阻断变株、吸水链霉菌 17997gdmP阻断变株的发酵产物中提取；GF254TLC 硅胶板为青岛海洋化工分厂产品；葡萄糖、乙酸乙酯等普通化学试剂为北京化工厂化学或分析纯产品；甲醇为美国 Fisher 公司HPLC 级产品。

1.1.3 仪器 Agilent 1200 型高效液相色谱仪为美国 Agilent公司产品；QTRAP 型质谱为美国 Applied Biosystems/MSD SCIEX 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 珍贵橙色束丝放线菌 ATCC 31565 的培养 甘油管冷冻保藏的珍贵橙色束丝放线菌 ATCC 31565 孢子悬液，接种于 MY 培养基（培养基组成：酵母提取物 0.4%，麦芽提取物 1.0%，葡萄糖 0.4%，琼脂粉 1.5%），28℃培养 4～5 d。

1.2.2 生物转化 珍贵橙色束丝放线菌 ATCC 31565 的每个 MY 培养平皿（直径 9cm），加入 CT-1-7 溶液（溶于二甲基亚砜，20 mg/ml）250 μl，终浓度 200 μg/ml，涂匀，28℃继续培养 24～36 h。

1.2.3 生物转化产物提取 取一个生物转化平皿，将其中的 MY 琼脂培养物切碎为长宽约 0.5cm×0.5cm 大小的琼脂块，转入三角瓶中，加入约 40 ml 乙酸乙酯提取 24 h，倾出提取液，室温挥干后，用约 500 μl 乙酸乙酯复溶。

1.2.4 生物转化产物检测 硅胶板 TLC 检测，采用乙酸乙酯-二氯甲烷-正己烷-甲醇（9∶6∶6∶1）溶媒系统展层；展层结束后，用少量 NaOH（2.0 mol/L）溶液喷涂[10]，照相记录。

1.2.5 生物转化产物的 LC-MS/MS 分析 将目标生物转化产物从 TLC 硅胶板上刮下，乙酸乙酯洗脱回收并挥干，复溶于少量甲醇中，进行 LC-MS/MS 分析。Agilent 1200 型液相色谱系统与 QTRAP LC-MS-MS 质谱仪联用，配Turbo Ionspray 离子化源。液相色谱条件：Dikma Diamonsil C18反相色谱柱，5 μm，150mm×4.6mm；30%～100%甲醇梯度洗脱 30min；流速 1 ml/min；检测波长 304 nm。质谱检测条件：喷雾电压 5.5 kV；温度 450℃；解簇电压 80 V；雾化气 40 相对单位，辅助气 30 相对单位，均为氮气；全扫描监测，正离子方式，质荷比（m/z）范围为100～1000；采用信息依赖扫描模式获得二级质谱；碰撞压力设为高；碰撞能量为35 eV。

2 结果

2.1 生物转化产物 TLC 检测结果

对 4,5-双氢-7-去氨甲酰基-7-羟基格尔德霉素（CT-1-7，化学结构见图2）。在珍贵橙色束丝放线菌 ATCC 31565 中的生物转化产物进行硅胶板 TLC 和 NaOH 显色，发现有新的生物转化产物出现（图3），并且与 4,5-H2GDM 具有相同的Rf值。

图2 CT-1-7（左）和 4,5-H2GDM（右）的化学结构

图3 CT-1-7 生物转化产物的硅胶板 TLC 检测

2.2 LC-MS/MS 分析结果

图4 4,5-H2GDM 的 LC-MS/MS 确证

从 TLC 硅胶板上回收转化产物条带后进行 HPLC 分析，主峰的保留时间（24.47min）和紫外吸收光谱（图4A）与 4,5-H2GDM 对照品一致，因此推测该化合物为4,5-H2GDM；对该化合物进行质谱分析（图4B），显示其分子量和二级质谱特征均与 4,5-H2GDM 一致[11]，证实该化合物为4,5-H2GDM，化学结构见图2。

3 讨论

Hu 等[12]利用除莠霉素（herbimycin）与 GDM 的化学结构相似性，在除莠霉素产生菌——Streptomyces hygroscopicusAM 3672 中对 GDM 进行了生物转化研究，获得了格尔德霉素衍生物——15-羟基格尔德霉素。本文将 GDM 生物合成中间产物 4,5-双氢-7-去氨甲酰基-7-羟基格尔德霉素（CT-1-7）加入到 ASM 产生菌——珍贵橙色束丝放线菌Actinosynnema pretiosumATCC 31565 中，获得了 4,5-双氢格尔德霉素，说明参与 ASM 生物合成 PKS 后修饰的氨甲酰基转移酶能够识别并催化 CT-1-7 氨甲酰基化。此外，本文作者还分别利用珍贵橙色束丝放线菌 ATCC 31565 对GDM 以及另外一个 GDM 生物合成中间产物（17-O-demethylreblastatin，即 17-hydroxy-progeldanamycin）[13]进行了生物转化实验，但未检测到生物转化产物，提示安丝菌素生物合成 PKS 后修饰除了氨甲酰基化以外的其他修饰步骤不能对格尔德霉素及其生物合成中间产物发生作用。考虑到前格尔德霉素（progeldanamycin，化学结构见图1）与前安丝菌素（proansamitocin，化学结构见图1）在结构上非常相似，今后如可获得前格尔德霉素，还可采用前格尔德霉素作为生物转化底物，探讨获得格尔德霉素衍生物（杂合抗生素）的可能性。

CT-1-7 在珍贵橙色束丝放线菌 ATCC 31565 中的氨甲酰基化产率较低（约 5%～10%），推测主要是由于在珍贵橙色束丝放线菌 ATCC 31565 中存在 ASM 生物合成中间产物的竞争作用；预计阻断 ASM 生物合成，可显著提高其氨甲酰基化产率。

对参与 GDM 与 ASM 生物合成 PKS 后修饰的氨甲酰基转移酶进行氨基酸序列比对（alignment），发现两者有60%相同性（identities）、70%相似性（positives），因此，推测这两个酶在空间结构上非常相似；由于两者所催化底物的化学结构又比较相似，它们在催化功能上可以互相替换并不令人意外，本文的生物转化实验结果对此予以了证实。

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