SPAG9mRNA在DAC干预A549细胞前后的表达

徐丽娜，刘倩，＊宋庆军

(菏泽医学专科学校，山东 菏泽 274000;⋆济南市长清区人民医院)

SPAG9mRNA在DAC干预A549细胞前后的表达

徐丽娜，刘倩，＊宋庆军

(菏泽医学专科学校，山东 菏泽 274000;⋆济南市长清区人民医院)

目的 检测DAC干预前后A549细胞中SPAG9的表达，探讨SPAG9表达的生物学机制。方法实时荧光定量PCR（RQ-PCR）法检测肺组织标本和DAC干预A549细胞前后SPAG9mRNA的转录情况。结果DAC干预A549细胞前后SPAG9的表达差异性显著,随甲基化状态的延长而减弱。结论低甲基化状态抑制SPAG9表达。SPAG9在肺癌的早期高度表达，中晚期表达减弱，可作为肺癌早期诊断和治疗的生物学参考指标之一。

SPAG9；肿瘤睾丸抗原；A549细胞

肿瘤睾丸抗原（cancer/testis antigens，CTA）是一类仅在睾丸组织正常表达或极少数正常器官组织中弱表达而在肿瘤组织表达增强的肿瘤相关抗原。SPAG9是2004年新发现的CTA家族中的一员，属于c-junNH2-termina-kinase（JNK）相互作用蛋白家族（JIP）的新成员且仅在睾丸组织中表达。CT抗原在肿瘤中的表达机制的研究并不清楚，目前主要有两方面解释一是低甲基化状态，二是组蛋白乙酰化。我们选择A549细胞株利用细胞的甲基化诱导抑制剂5-AZn-2’脱氧胞苷酸（DAC）对其干预，观察DAC干预后细胞在低甲基化状态SPAG9基因的表达情况，验证低甲基化状态下对于CT抗原在肿瘤细胞中表达的影响。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞株 人肺腺癌A549细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

1.1.2 主要试剂与仪器 1）RPMI 1640培养基（Gibco公司）。2）新生牛血清（武汉三利生物制品厂）。3）5-AZn-2’脱氧胞苷酸（Sigma公司）。4）RQ-PCR试剂：DEPC购自Sigma公司，Trizol试剂、SS II逆转录试剂盒、EB染料均购自Invitrogen公司。SYBR GREEN supermix试剂购自STRATAGENE公司，编号600548。 DNA Extraction kit胶回收试剂盒，MBI公司。TA克隆试剂盒购于Promega公司；质粒小提试剂盒（Promega公司）。

引物合成：依据PCR引物的设计原则，首先在PUBMED数据库中检索SPAG9、GAPDH的全长mRNA序列，设计引物序列，引物由上海生工生物技术公司合成。SPAG9上游引物序列：GAGGACGGTGTGGTGTATCAG，下游引物序列：GTCATAGCGCCCGATAAGCC，扩增基因片段长度为120bp；以GAPDH为内参照，上游引物序列：GCTGGTCATCAACGGGAAA，下游引物序列：ACGCCAGTAGACTCCACGACA；扩增基因片段长度为105bp。

1.2 方法

1.2.1 不同培养时间不同浓度DAC对肺癌A549细胞的影响试验（干预） 取对数生长期A549细胞按1×104孔接种于20μl 96孔培养板，每孔加培养液200μl。设单细胞悬液，置5%CO2培养箱37°。设对照组（未干预组）和DAC干预组，终浓度分别为10、25、50、100μmol/L。继续培养24h、3d、5d、7d，在培养规定的时间后，每个浓度每个时间点设3个复孔。每孔加入20μlMTT液，继续培养4h后吸去培养液，加入二甲基亚砜200μl，用摇床振荡5min，然后用在570nm处测OD值。细胞存活率=（DAC组A值/对照组A值）×100%。

1.2.2 RQ-PCR检测 A549细胞株DAC干预前后SPAG 9mRNA表达。取对数生长期A549细胞按2×106孔接种于6孔培养板，每孔加培养液800μl。5%CO2的条件下37℃培养24h后，设对照组和DAC干预组，干预组终浓度为100μmol/L。放置5%CO2培养箱37℃继续培养，培养过程中细胞的传代按常规方法进行，传代后培养液中保持DAC的浓度。在培养规定的时间后，吸出培养液，每孔加入1ml Trizol，室温静置5min后，将液体移入1.5ml离心管中。其余方法同组织实验。实验重复三次。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析，组间均数（以GAPDH为内参，RQ-PCR以SPAG9拷贝数/GAPDH拷贝数，WB法采用二者灰度值之比）比较采用方差分析。

2 结果

2.1 不同培养时间及不同干预浓度对肺癌 A549细胞的影响试验（干预）结果见表1。

嘧啶（5-MC）。目前认为DNA甲基化是基因表达调控的机制之一，主要通过以下三方面影响基因的转录：1）DNA的甲基化改变了DNA分子的空间构象，从而影响基因表达。2）基因启动子区域高甲基化状态直接阻碍转录因子与启动子的结合。3）高甲基化的CpG通过特异的甲基化结合蛋白与组蛋白

表1 不同培养时间及不同干预浓度对肺癌A549细胞的影响试验（±s）

表1 不同培养时间及不同干预浓度对肺癌A549细胞的影响试验（±s）

剂量度 0d 1d 3d 5d 7d对照组 0.644±0.1720.587±0.5650.785±0.0600.839±0.0210.652±0.01010μmol/L 0.646±0.0320.644±0.0070.586±0.0500.609±0.0390.512±0.01025μmol/L 0.586±0.0460.543±0.0250.534±0.0120.515±0.0160.486±0.03550μmol/L 0.613±0.0260.561±0.0390.467±0.0210.434±0.0250.417±0.015100μmol/L 0.593±0.0280.541±0.0150.424±0.0130.397±0.0380.322±0.009

2.2 SPAG9mRNA在DAC干预A549细胞前后的表达 图1显示SPAG9PCR反应产物为长度120bp的片断，与设计的引物相符，GAPDH图片显示PCR反应产物为一长度105bp的片断，与设计的引物相符。

图2示实时荧光定量PCR法检测SPAG 9mRNA在DAC干预A549细胞后不同时间的表达水平。

3 讨论

肿瘤睾丸抗原由于其在肿瘤中限制性表达而在正常组织不表达的特征使其作为肿瘤治疗的靶标成为研究的新热点。对此类抗原的研究多放在肿瘤的免疫治疗和新抗原的发现方面，对于CT抗原的表达机制的研究较少。CT抗原在肿瘤中的表达的生物学机制尚不清楚。DNA甲基化异常是肿瘤的一个较普遍的特征，也是细胞恶变的早期现象并参与肿瘤的进展。它主要表现为癌基因的低甲基化和抑癌基因启动子区域的高甲基化。目前研究表明，癌基因DNA的低甲基化可激活癌基因的表达，而抑癌基因DNA的高甲基化可使抑癌基因的表达失活，其结果类同于基因缺失或突变而造成的基因功能丧失，导致肿瘤的发生[1-3]。癌基因低甲基化在恶性肿瘤中广泛存在[4-5]。在实体瘤如转移的肝细胞癌[6]、前列腺癌[7]以及在恶性血液病如B-细胞慢性淋巴细胞性白血病[8]中都很普遍。低甲基化程度与与恶性程度呈正比关系。

DNA甲基化主要指在CPG二核苷酸中胞嘧啶的5位碳原子上加上一个甲基基团，形成5甲基胞去乙酰化酶（histonedeacetylase，HDAC）协同作用，增强HDAC去乙酰化的活性，从而导致基因转录失活[9]。

由于DNA的甲基化不涉及DNA序列本身的改变，所以这种改变是可逆的，因此可以通过消除基因启动子区域的甲基化状态，在癌变过程中，使异常甲基化逆转，特别是癌变早期的转变对肿瘤的防治尤为重要。DAC是脱氧胞苷的类似物，可以通过整合

入DNA，进而干扰DNA对甲基的接受能力，或直接抑制DNA甲基转移酶活性，最终导致DNA甲基在细胞分裂周期中进行性丢失产生低甲基化，从而使某些基因重新激活。

我们选择A549细胞株在DAC不同剂量及不同时间段干预后显微镜下观察发现，A549细胞出现明显的皱缩、死亡，细胞密度有不同程度的减少。在一定的范围内，随着剂量的增高和作用时间的延长，对肺癌细胞增殖的抑制作用越明显。这与文献报道DAC抑制肿瘤细胞增生，诱导细胞凋亡的作用相符合。我们利用DAC干预后使A549细胞处于低甲基化状态进一步来检测SPAG9在A549细胞干预前后的表达，结果发现SPAG9的基因表达较对照组显著减弱，实验组在1d、3d、5d、7d四个时间点也呈现表达的逐步减弱，各时间段间比较差异显著。这个结果与前面我们在肺癌组织中的发现是相呼应一致的。这也证实SPAG9在肺癌的早期高度表达，在中晚期表达减弱，可作为肺癌早期诊断和治疗的生物学参考指标之一。

综上所述，通过对A549腺癌细胞株的DAC干预，在不同时间段检测细胞中SPAG9的表达异常。我们发现A549细胞在低甲基化状态下，SPAG9的基因和蛋白质的表达随低甲基化程度增强而减弱。这从另一方面也证实了SPAG9在肺癌中的早期高度表达，中晚期表达减弱，可作为肺癌早期诊断和治疗的生物学参考指标之一。

[1]朱波，陈正堂.5-氮-2′-脱氧胞嘧啶诱导肺腺癌A549细胞株TRAG-3肿瘤抗原表达[J].重庆医学，2004，7，985-988.

[2]Sigalotti L，Fratta E，Coral S，et al.Intratumor heterogeneity of can cer/testis antigens expression in human cutaneous melanoma is meth ylation-regulated and functionally reverted by 5-aza-2-deoxycyti dine[J].Cancer Research，2004，64（24），9167-9171.

[3]Z.Sheng Guo，Julie A.Hong，Kari R.Irvine et al.De novo Induction of a Cancer/Testis Antigen by 5-Aza-2'-Deoxycytidine Augments Adoptive Immunotherapy in a Maurine Tumor Model[J].Cancer Re search，2006，66，1105-1113.

[4]ScanlanMJ，Gure AO，Jungbluth AA，et al.Cancer/testis anti gens：an expanding family of targets for cancer immunotherapy[J].Immunol Rev，2002，188：22-32.

[5]赵力,冷希圣,彭吉润,等.4种肿瘤睾丸抗原在肝细胞癌中的表达[J].中华实验外科杂志，2004，9，1049-1050.

[6]赵飞兰,何少健,黎鹏,等.癌-睾丸抗原GAGE基因mRNA在肝细胞癌的表达及临床意义[J].中华肝脏病杂志，2006，14（8）:605-606.

[7]JA Dubovsky and DG McNeel.Inducible expression of a prostate can cer-testis antigen，SSX-2，following treatment with a DNA methyl ation inhibitor[J].Prostate，2007，67（16）：1781-1790.

[8]Y Lu，LQ Wu，ZH Lu，etal.Expression of SSX-1and NY-ESO-1mRNA in tumor tissues and its corresponding peripheral blood ex pression in patients with hepatocellular carcinoma[J].Chin Med J（Engl），2007，120（12）：1042-1046.

[9]Shiota K.DNA methylation profiles of CpG islands for cellular dif ferent ion and development in mammals[J].Cytogenet Genome Res，2004，105（24）：325-334.

R318;Q2

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1008-4118（2011）02-0018-03

10.3969/j.issn.1008-4118.2011.02.08

2011-04-04