花粉管通道法转基因对小麦主要农艺性状的影响

周岩,游建,魏琦超,薛晓锋,何男男,马俊

（河南科技学院,河南新乡453003）

花粉管通道法最早可能要追溯至Pandy以烟草为材料,将供体品种的花粉经射线杀死后与受体品种的花粉混合后授粉,结果获得了供体花色性状的变异,认为经过射线照射的花粉其遗传物质可不经过胚子融合而发生基因转化[1].20世纪70年代中国学者周光宇先生将外源海岛棉DNA导入陆地棉,培育出抗萎病的栽培新品种,正式创立该法,其理论假说是存在染色体水平以下的DNA片段杂交,外源DNA片段在授粉后通过花粉管进入胚囊,最终整合到植物基因组中[2-3].花粉管通道法转基因技术具有操作方法简单,不需要组织培养等过程直接获得转基因种子等优点[4].迄今为止,利用花粉管通道法已获得了水稻、小麦、棉花、大豆、玉米等20多种转基因作物[5].在小麦方面,已育成了多个新品种（系）,如长穗冰草DNA导入的抗旱耐盐新品种济南18号[6],含耐盐基因HVAI的转基因小麦[7],芦苇草DNA导入的抗盐新品种系[8].曾君祉等用花粉管通道法将带GUS标记基因的质粒PBI121导入普通小麦,获得转基因植株,经点杂交初步筛选,再经Southern分子杂交鉴定,确定获得了转基因植株,同时用荧光法和X-Gluc染色法检测,证实了这些植株中有GUS基因的表达产物—葡糖苷酸酶（GUS）存在,证明GUS基因已整合到小麦植株中,并能在植物体中表达[9].Chong等报道了用该法转化小麦,经过Southern和Southern Blot及Northern Blot鉴定以及表达产物的检测,获得了小麦转基因植株[10].李忠杰通过花粉管通道法,将广用途几丁质酶基因和葡聚糖酶基因（连锁有GUS基因）导入到受体小麦龙辐91B569中,在D1和D2代跟踪接种鉴定抗病性并检测GUS基因活性[11].

本研究主要通过花粉管通道法将携带有外源耐盐基因SeNHX1的质粒DNA对百农-64（BN-64）、豫麦 -34（YM-34）、百麦 -1（BM-1）和矮抗 -58（AK-58）等 4 个小麦品种进行转化处理,分别对转化后的不同品种及对照进行农艺性状测定和统计学分析,以探讨花粉管通道法转基因对小麦农艺性状的影响,同时期望获得新的变异类型,为今后小麦育种提供新的试验方法和技术参考.

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 植物材料 百农-64、豫麦-34、百麦-1、矮抗-58等4个品种,由河南科技学院小麦研究中心提供.所试品系均田间栽培,按常规方法进行田间管理.

1.1.2 菌种和质粒 大肠杆菌菌种（Escherichia coli DH5α）由河南科技学院作物基因组学与遗传改良实验室提供；该菌携带含有SeNHX1基因的质粒,可在大肠杆菌中扩增,质粒构建融合见图1：

图1 融合基因SeNHX1表达载体结构

1.2 试验方法

1.2.1 大肠杆菌的富集培养 配制含50 mg/LKan的LB培养基做平板,50 mg/LKan的LB液体培养基,准备培养皿、三角瓶、接种环等.用接种环蘸取少许保存菌液接种于液体培养基中,在37℃,170 rpm条件下过夜培养.用接种环蘸取少许活化菌液在固体培养基平板上划线,倒置,37℃条件下过夜培养.用接种环（灭过菌）挑取一个白色圆形单菌落加入20 mL含有50 mg/LKan的液体LB培养基中培养过夜（37℃,170 rpm）得到富集培养的活化的大肠杆菌菌液.按上述方法得到大肠杆菌菌液若干后提取质粒.

1.2.2 质粒的提取 采用碱裂解法[12]提取大肠杆菌中的含SeNHX1基因质粒.用1×TE（pH8.0）溶液溶解后调至300 μg/mL,质粒DNA浓度及质量分光光度计及琼脂糖凝胶电泳检测,测定OD280、OD260、OD230值,计算DNA浓度和纯度,当DNA样品达到1.8≤OD260/OD280≤2.0,OD260/OD230≥2.0时备用[11].

1.2.3 花粉管通道法转化SeNHX1基因 秋分时将种子播种于大田,行长6 m,行间距0.2 m,每行播种约100粒种子,出苗、越冬,正常田间管理.在小麦自花授粉以后1.0～1.5 h之内剪去柱头,采用柱头滴加法,用微量注射器滴加10 μL上述备用质粒DNA溶液,间隔30 min再重复一次.TE处理作为对照,套袋、标明时间及质粒DNA浓度,直至小麦成熟后收获得到种子.

1.2.4花粉管通道法转化后D0代种子的获得及其农艺性状的测量 花粉管通道法转化处理的当代收获种子记为D0代种子,次年记为D1代种子.将获得的D0代种子,点播在同一试验田,行长、行间距及每行播种粒数同1.2.3所述.采用五点取样,每品系随机选取30株D0代植株,于去年同期对D0代的株高、穗长、旗叶长、旗叶宽、旗叶面积、千粒重等农艺性状进行测量及统计分析.

2 结果与分析

2.1 花粉管通道法转化SeNHX1基因对D0代植株株高、穗长的影响

将携带有外源耐盐基因SeNHX1的质粒DNA导入4个小麦品种之中,对D0代植株田间农艺性状株高、穗长统计分析结果见表1.

表1 转基因D0代株高、穗长统计分析

从表1可看出,与对照组相比,花粉管通道法处理的D0代植株株高与穗长均呈上升趋势,株高差异均达到极显著水平,穗长除BM-1差异不显著外,其余均达显著水平.以上结果表明,花粉管通道法处理对4个小麦品种的株高、穗长均有不同程度影响,并且不同品种对外源基因的导入反应不同.

2.2 花粉管通道法转化处理对D0代植株旗叶长、宽、叶面积的影响

将携带有外源耐盐基因SeNHX1的质粒DNA导入4个小麦品种之中,对D0代植株田间农艺性状旗叶叶面积统计分析结果见表2.

表2 转基因D0代旗叶叶面积统计分析

从表2可以看出,与对照相比,除YM-34叶长有所下降外,其余各品种的叶长、叶宽、叶面积均呈上升趋势；叶面积差异均达到极显著水平；叶长除YM-34外其余受体差异均达到极显著水平；叶宽与受体相比均无明显差异.由此可见,用花粉管通道法将SeNHX1基因导入小麦对小麦叶长、叶面积影响巨大.

2.3 花粉管通道法转化处理对小麦种子千粒重的影响

将携带有外源耐盐基因SeNHX1的质粒DNA导入4个小麦品种之中,对D0代植株田间农艺性状D0代（D1代种子）千粒重统计分析结果见表3.

表3 D1代种子千粒重统计分析

由表3可知,除了AK-58转化处理后千粒重下降外,其余品种转入基因后千粒重都有所增加；BM-1千粒重差异达到显著水平,YM-34千粒重差异甚至达到极显著水平.由此可见,花粉管通道法处理可能对小麦产量增加有一定的积极作用.

3 小结

小麦属于部分同源异源六倍体植物（AABBDD）,遗传背景繁杂多样.A、B、D三个染色体组间具有补偿作用,外源基因转入后的遗传和表达,以及外源基因插入对植株生长发育的影响势必较其他二倍体植物复杂的多[13].所以,在转基因小麦研究中,不但要求导入的外源基因表达水平高,遗传稳定,而且转化处理后对受体主要农艺性状没有不利影响.本研究利用花粉管通道法将耐盐基因SeNHX1转化4个小麦品种BN-64、YM-34、BM-1和AK-58,并对花粉管通道法处理的D0代的农艺性状进行了测定.经统计学分析后发现,与对照相比,D0代植株在株高、穗长、旗叶面积及千粒重均发生了不同程度的变化,有的性状如旗叶面积甚至达到极显著差异水平,并且不同受体对其转化处理的差异显著性有所区别,这与胡文明等得到的结果相一致[14].从总体上看,与对照相比,4个品种的千粒重呈上升趋势（AK-58略有下降）.奚亚军等以西农1376和中13为材料进行研究时发现不同基因型及转化时间对结实率影响不显著,这些与我们的研究结果相一致[15].在小麦生长后期,旗叶的光合效率最高,对子粒形成和产量的贡献最大.所以,选育旗叶叶面积大的小麦品种是提升小麦产量的关键[14].对转化处理后的植株进行PCR扩增,出现了部分阳性扩增结果（结果未出示）,初步证明外源耐盐基因SeNHX1已通过花粉管通道法导入并整合到小麦基因组DNA中.综上所述,本研究表明,花粉管通道法介导的基因转移处理方法对小麦的主要农艺性状有一定的正向促进作用.该研究所采用的技术和方法可为小麦种质资源的创新及遗传改良提供一定的实验参考和借鉴.

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