欧洲鳗迟钝爱德华氏菌的分离鉴定*

陈 强,龚 晖,杨金先

迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)隶属肠杆菌科,爱德华氏菌属,是导致人兽共患病的一种常见病原菌,其流行区域广,宿主种类多,对养殖业特别是鳗鲡养殖业产生巨大的影响。1962年Hoshina[1]首次报道该菌与日本鳗(Anguilla japonica)红病有关。随后,国内许多学者开始对鳗鲡爱德华氏菌进行了相关的研究。韩先朴等[2]从福建日本鳗体内分离到“福建爱德华氏菌”。王国良等[3]从浙江日本鳗体内分离到“浙江爱德华氏菌”。卢全章等[4]认为引起广东省日本鳗肝肾病的病原是迟钝爱德华氏菌和运动性气单胞菌;董传甫等[5]发现引起日本鳗败血腹水病的病原菌除了迟钝爱德华氏菌,还有温和气单胞菌(Aeromonas sobria)和嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)。余露军等[6]从患病日本鳗体内分别检测到迟钝爱德华氏菌和创伤弧菌(Vibrio vulnificus)。因此,病原菌的鉴定是鳗鲡疾病确诊的关键。但目前未见对欧洲鳗(Anguilla anguilla)迟钝爱德华氏菌进行分离鉴定的报道。本试验采用病原菌分离培养、形态特征观察、生化特性鉴定、16SrDNA序列分析和属特异性PCR技术对欧洲鳗迟钝爱德华氏菌进行鉴定,以期为欧洲鳗迟钝爱德华氏菌的快速确诊、人兽共患病的研究和防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 API 20E细菌鉴定试剂盒,购自法国生物梅里埃公司;DNTP、TaqDNA聚合酶购自Takara。

1.2 病原菌的分离培养 2008年11月至2009年1月,福建长乐某欧洲鳗养殖场部分养殖池内泡沫增多,病鳗头腹朝天,行单鳃呼吸。其皮肤和鳍条有明显的出血点,前胸部肿大,腹壁出现穿孔。腹腔内含浑浊液体,肝脏肿大,形成数个大小不等的化脓病灶。肝区腹腔内壁软化,内膜穿孔,并有大量的出血点。部分病死鳗肛门红肿,消化道无肉眼可见的病变。无菌条件下取病鳗的肝组织划线接种于胰胨大豆琼脂(TSA)平板,25℃培养24～48h,分离出病原菌。挑取形态特征一致的优势菌落进行纯化培养,观察细菌生长情况和菌落特征,然后对单菌落进行革兰氏染色,镜检细菌形态。

1.3 病原菌的人工感染试验 将35尾健康的欧洲鳗(平均体质量 15g),随机分成 5组,分别置于60cm×50cm×40cm水族箱中。纯培养菌按1%的比例接种于营养肉汤,25℃培养24h,活菌计数后用PBS稀释成一定的浓度,每组按每克体重1×104、1×105、1×106、1×107cfu/m l的浓度腹腔注射欧洲鳗,剂量为0.1m L。对照组注射PBS。试验期间水温为17～18℃,充氧,每日换水 50%,及时清除并记录各组鳗鲡的死亡数量。连续观察15d,直至无新增死亡为止。用SPSS 13.0软件采用概率单位法进行半数致死量(LD50)的计算[7]。

1.4 病原菌的生化特性鉴定 取纯培养菌,按API 20E细菌鉴定试剂盒的操作步骤进行硝酸盐还原、氧化酶、阿拉伯糖、苦杏仁苷、蜜二糖、蔗糖、鼠李糖、山梨醇、肌醇、甘露醇、葡萄糖、明胶酶、V-P反应、吲哚产生、色氨酸脱氨酶、脲酶、H2S产生、柠檬酸利用、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、β-半乳糖苷酶的生化特性测定。

1.5 病原菌的16SrDNA鉴定 将纯培养菌接种于营养肉汤,25℃培养24h,离心后收集菌体,按煮沸法提取模板DNA。参照文献[8]设计扩增引物P1和P2(见表1)。引物由上海生工公司合成。PCR扩增按常规方法进行,反应体积 20μl,其中 10×buffer2.0μL,1.5mmol/LMgCl2 1.6μL,10mmol/L 4×DNTP 0.4μL,引物 P1、P2 各 0.2μL,2.5U/μL TaqDNA 聚 合酶 0.2μL,模 板 DNA l.0μL,用ddH2 O补至 20μL。PCR反应程序为:96℃预变性6min,95℃变性1min,55℃复性1min,72℃延伸2min,30个循环后72℃温育5min。扩增产物送上海生工公司测序。接着采用NCBI的BLAST软件查询所测菌株的16SrDNA序列的属性,将其与从GenBank数据库中获得的同属菌的16S rDNA基因,进行同源性序列比对分析,然后构建菌株系统发育进化树。

1.6 病原菌的特异性PCR鉴定 参照文献[9]设计4对扩增引物P3～P10(见表1),对应致病性爱德华氏菌属的鞭毛蛋白基因簇。PCR扩增方法参照1.5,其中复性退火温度见表1。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后拍照观察。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离培养 病原菌生长较缓慢,在TSA培养基上培养24h后菌落为针尖大小,48h后形成圆形光滑、半透明的灰白色小菌落。革兰氏阴性杆菌,菌体直、单个。将病原菌编号为ET81126。

2.2 病原菌的人工感染试验 在为期15d的感染试验中,剂量为1×106cfu/g试验组在第5d全部死亡;1×105cfu/g试验组在第8d共死了6尾;1×104cfu/g试验组从第9d开始出现死亡,到第14d共死了3尾。试验过程中,大部分鱼在死亡前后出现了比较明显的肝脏型症状,与养殖场中发现的病鳗症状基本一致。而1×103cfu/g试验组和对照组的欧洲鳗活动正常,外观无明显改变。利用SPSS软件算得半数致死量(LD50)为4.55×104cfu/g(见表2)。

表1 试验所用的PCR引物Tab.1 PCR primers used in this experiment

表2 菌株ET81126对欧洲鳗的致病性试验Tab.2 The pathogenicity of strain ET81126 to European eel

2.3 病原菌的生化特性鉴定 菌株81126的生化特性鉴定见表3,除了甘露醇、阿拉伯糖阳性外,其它均与陈翠珍[10]对迟钝爱德华氏菌的描述相同,可初步判断分离菌为爱德华氏菌。硝酸盐还原、氧化酶、阿拉伯糖、苦杏仁苷、蜜二糖、蔗糖、鼠李糖、山梨醇、肌醇、甘露醇、葡萄糖、明胶酶、V-P反应、吲哚产生、色氨酸脱氨酶、脲酶、H2S产生、柠檬酸利用、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、β-半乳糖苷酶的生化特性测定。

2.4 病原菌的16SrDNA鉴定 菌株ET81126经PCR扩增所获得的16SrDNA基因部分序列长度为1508bp。在GenBank中进行16SrDNA基因同源性序列检索,结果显示菌株ET81126的序列与爱德华氏菌的同源率为97%～99%。后选择同源率为99%的5株细菌构建系统发育进化树,结果显示菌株ET81126与迟钝爱德华氏菌(登录号EF467289)自然聚为1支。综合生化指标和16SrDNA基因序列分析结果,可将菌株ET81126鉴定为迟钝爱德华氏菌。

2.5 病原菌的特异性PCR鉴定结果 菌株ET81126经特异性PCR扩增和凝胶电泳,结果显示:引物 P3/P4和 P9/P10分别出现 848bp和230bp的DNA片段,其它2对引物无扩增条带(图1)。进一步证实菌株ET81126为迟钝爱德华氏菌非典型菌株(E.tarda A typical)。

3 讨 论

迟钝爱德华氏菌可感染日本鳗生长的整个阶段,特别是早期(如白仔鳗、黑仔鳗、幼鳗),死亡率更高。其原因可能是日本鳗对迟钝爱德华氏菌较敏感,但欧洲鳗对该菌的抗性较强,一般只在白仔或黑仔阶段发生轻度感染,且常常分离不到致病菌,因此,对欧洲鳗迟钝爱德华氏菌病的报道较少。本试验从患典型“肝脏脓肿”的越冬成鳗中分离到迟钝爱德华氏菌菌株ET81126,通过人工感染试验证实菌株ET81126对欧洲鳗具有高度的致病性,半数致死量(LD50)为4.55×104cfu/g,说明该菌对鳗鲡的感染力已逐渐增强,且其宿主的种类也已增加。

表3 菌株ET81126的主要生化指标Tab.3 Main biochemical characteristics of strain ET81126

图1 菌株ET81126的PCR扩增图谱Fig.1 PCR finger print of strain ET81126

对于病原菌的鉴定,以传统细菌学检测方法中的生化特性鉴定最为常见。但由于生化特性鉴定操作繁琐、耗时长且至今缺乏水产动物病原细菌专用的鉴定系统,包括培养温度、孵育时间、生化指标数据库等。因此,对水产动物病原细菌的生化鉴定仍然是借鉴动物源细菌的鉴定方法。本试验采用快速诊断鱼类细菌性疾病的API 20E生化系统进行鉴定,结果显示菌株ET81126利用甘露醇和阿拉伯糖,产生 H2S,与陈翠珍[10]报道的结果不一致,无法将其归为迟钝爱德华氏菌野生菌型或生物群1。其原因可能是API 20E系统设计的初衷是快速鉴别动物肠道革兰氏阴性菌,且检测的生化指标数量有限,造成对水产动物病原细菌的鉴定存在一定的误差[11]。因此,目前生化特性指标的鉴定结果多作为分子生物学或免疫学等其它鉴定方法的佐证。

随着分子生物学的发展,16S rDNA测序是目前细菌分类和鉴定的一个有力工具,已广泛用于多种鱼类迟钝爱德华氏菌的检测,如日本鳗[6]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[12]、牙鲆(Para lichthysolivaceus)[13]、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)[14]、地图鱼(Astronotusocellatus)[15]、斑点叉尾鮰(Icta lurus punctatus)[16]、罗非鱼(Tilapia nilotica)[17]。本试验对欧洲鳗病原菌进行16S rDNA测序,表明分离菌与迟钝爱德华氏菌自然聚为一支,可确定分离菌为迟钝爱德华氏菌。因此,16S rDNA鉴定可为欧洲鳗迟钝爱德华氏菌感染提供早期、快速、敏感、准确的检测。但是细菌的16S rDNA序列高度同源,只有少量碱基差异,通过NCBIBLASTN分析得到大量的同源序列,造成结果分析过程冗长复杂。因此,借助细菌种属特异性引物进行PCR扩增爱德华氏菌属的鞭毛基因簇,可以快速鉴别爱德华氏菌属、种及其分型。本研究通过特异性PCR鉴定,进一步确定菌株ET81126为迟钝爱德华氏菌非典型菌株(E.tarda Atypical)。至于迟钝爱德华氏菌的PCR分型方法(Typical、A typical)与传统的分型方法(野生菌群、生物群1)之间的关系目前尚不明了,有待于进一步的研究探讨。

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