地黄饮子对慢性脑低灌注大鼠学习记忆及海马基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9的影响※

李瑞杰 白黎明 张哓双

(河北省新乐市中医院中风病科，河北 新乐 050700)

地黄饮子对慢性脑低灌注大鼠学习记忆及海马基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9的影响※

李瑞杰 白黎明1张哓双2

(河北省新乐市中医院中风病科，河北 新乐 050700)

目的 探讨地黄饮子对慢性脑低灌注大鼠学习记忆及海马基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的影响。方法 将50只SD大鼠随机分为假手术组、模型对照组、地黄饮子大剂量组、地黄饮子小剂量组及养血清脑颗粒组，每组各10只。采用双侧颈总动脉结扎制作大鼠慢性脑缺血模型，假手术组同样分离双侧颈总动脉，但不予结扎。每日灌胃给药1次，给药容积10 mL/kg，地黄饮子大、小剂量组分别为20、10 g/kg，养血清脑颗粒为2 g/kg，连续8周。假手术组和模型对照组灌胃等容积蒸馏水。采用Morris水迷宫法进行大鼠学习记忆功能的测定。并免疫组织化学法测定MMP-2、MMP-9表达。结果 以大鼠逃避潜伏期和跨越平台次数代表学习记忆能力，逃避潜伏期越短，跨越平台次数越多，记忆能力越强。模型对照组逃避潜伏期较假手术组长(P＜0.05)，跨越平台次数较假手术组少(P＜0.05)，说明结扎双侧颈总动脉模型可导致学习记忆功能下降。与模型对照组比较，地黄饮子组、养血清脑颗粒组逃避潜伏期均缩短(P＜0.05，P＜0.01)，跨越平台次数均增加(P＜0.05，P＜0.01)。与地黄饮子小剂量组比较，地黄饮子大剂量组、养血清脑颗粒组逃避潜伏期缩短(P＜0.05)，跨越平台次数增加(P＜0.05)。模型对照组海马组织MMP-2、MMP-9表达较假手术组增高(P＜0.01)。地黄饮子组、养血清脑颗粒组海马组织MMP-2、MMP-9表达均低于模型对照组(P＜0.05，P＜0.01)。地黄饮子大剂量组海马组织MMP-2、MMP-9表达低于地黄饮子小剂量组(P＜0.05)，养血清脑颗粒组海马组织MMP-2、MMP-9表达低于地黄饮子大剂量组(P＜0.05)。结论 地黄饮子能改善慢性低灌注大鼠学习记忆力功能，可能与抑制炎症反应及细胞凋亡有关。

地黄饮子;大鼠，SD;海马，化学;疾病模型，动物;颅内动静脉畸形，代谢;慢性病;脑缺血，代谢;再灌注损伤，代谢;基质金属蛋白酶2;基质金属蛋白酶9

慢性脑低灌注是各种原因引起的长期脑灌注不足，促使脑发生一系列病理生理改变，临床主要表现为进行性的学习、记忆等认知功能障碍，是血管性痴呆、初老期痴呆(Alzheimer病)和皮层下动脉硬化性脑病(Bingswanger)等多种疾病发展过程中的一个共同病理过程。随着年龄的增长，全脑或局部脑区慢性低灌注状态成为一种较常见的状态，在临床中脑低灌注状态得到了越来越多的认识和重视。地黄饮子具有滋肾阴、补肾阳、化痰开窍的功能，临床上观察到地黄饮子能够有效改善患者慢性脑血流灌注不足的症状。本实验旨在观察地黄饮子对大鼠慢性脑低灌注的作用效果及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 成年雄性SD大鼠50只，体质量(250±20)g，SPF级，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK(陕)2007-001。饲养于陕西中医学院中药药理学实验室，温度25℃，湿度45%。自由饮水，每日光照4 h。

1.1.2 实验药品及试剂 地黄饮子水煎液由陕西中医学院中药药理研究室制备，地黄饮子按原方比例(熟地黄18 g，巴戟天、山茱萸、石斛、肉苁蓉各 9 g，炮附子、五味子、肉桂、茯苓、麦门冬、石菖蒲、远志各6 g，薄荷、生姜、大枣各3 g)配伍，加10倍量水浸泡2 h，煎煮40 min后过滤煎液，再加8倍量水煎煮40 min，过滤煎液，合并2次滤液，用旋转蒸发仪浓缩至分别含生药2 g/mL和1 g/mL的药液后，无菌条件装瓶，置4℃冰箱备用。养血清脑颗粒(天津天士力制药股份有限公司，国药准字Z10960082)。基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.1.3 实验仪器 Morris水迷宫由中国医学科学院治疗所生产。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 50只SD大鼠，适应性喂养1周，随机分为假手术组、模型对照组、地黄饮子大剂量组、地黄饮子小剂量组和养血清脑颗粒组，每组各10只。

1.2.2 模型制备 术前12 h禁食，4 h禁水。用水合氯醛(青岛宇龙海藻有限公司，国药准字 H37022673)350 mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定，颈正中去毛，碘伏消毒，颈正中切开，仔细分离出双侧颈总动脉并结扎，假手术组同样分离双侧颈总动脉，但不予结扎。缝合切口后回笼饲养，青霉素抗感染4 d。

1.2.3 给药方法 每日灌胃给药1次，给药容积10 mL/kg，地黄饮子大、小剂量组分别为20、10 g/kg，养血清脑颗粒为2 g/kg，连续8周。假手术组和模型对照组灌胃等容积蒸馏水。

1.3 观察指标及方法

1.3.1 于给药后4、8周采用Morris水迷宫法进行大鼠学习记忆功能的测定。①定位航行试验:历时4 d，每日上、下午各2次，将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中，记录其在3 min内寻找到并爬上平台的时间即逃避潜伏期。如果大鼠在3 min未找到平台，则由实验者用手牵引其至平台上，让大鼠停留10 s再放回笼中，潜伏期记为最高分180 s。分别在给药后4、8周重新进行游泳实验，大鼠每次在3 min内寻找到并爬上平台的时间为大鼠的记忆成绩，每日2次，连续4 d，计算平均成绩。②空间探索实验:第5 d撤除平台，将大鼠任选1个入水点放入水中，测其2 min内跨越原平台所在位置的次数。上、下午各1次，计算平均成绩。

1.3.2 以大鼠逃避潜伏期和跨越平台次数代表学习记忆能力，逃避潜伏期越短，跨越平台次数越多，记忆能力越强。实验结束后大鼠经心脏灌注固定后取脑，固定，梯度酒精中脱水，脱水后浸蜡包埋，行冠状位连续切片，并将切片粘于多聚赖氨酸处理的载玻片上，烘干，免疫组织化学法测定 MMP-2、MMP-9。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学分析，计量资料用均数±标准差(±s)表示，采用方差分析，组间采用t检验。

2 结果

2.1 地黄饮子对慢性脑低灌注大鼠学习记忆功能的影响见表1。

表1 地黄饮子对慢性脑低灌注大鼠学习记忆功能的影响±s

表1 地黄饮子对慢性脑低灌注大鼠学习记忆功能的影响±s

与假手术组比较，*P ＜0.05;与模型对照组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;与地黄饮子小剂量组比较，#P ＜0.05

组 别 n 剂量(g/kg) 逃避潜伏期(s)跨越平台次数(次)4周 8周4周 8周假手术组 10 - 17.63 ±3.67 16.33 ±2.44 7.40 ±1.71 7.70 ±1.64模型对照组 10 - 47.30 ±7.66* 53.50 ±3.34* 3.00 ±1.41* 2.50 ±1.27*地黄饮子小剂量组 10 10 39.00±8.47△ 44.50±7.41△△ 4.30±1.16△ 4.00±1.05△地黄饮子大剂量组 10 20 34.30±7.35△△# 36.30±8.12△△# 4.80±1.23△# 4.50±1.2△△#养血清脑颗粒组 10 2 31.60±8.02△△# 34.60±9.73△△# 5.00±1.49△# 4.70±1.42△△#

由表1可见，模型对照组逃避潜伏期较假手术组长(P＜0.05)，跨越平台次数较假手术组少(P＜0.05)，说明结扎双侧颈总动脉模型可导致学习记忆功能下降。与模型对照组比较，地黄饮子组、养血清脑颗粒组逃避潜伏期均缩短(P＜0.05，P＜0.01)，跨越平台次数均增加(P＜0.05，P＜0.01)。与地黄饮子小剂量组比较，地黄饮子大剂量组、养血清脑颗粒组逃避潜伏期缩短(P＜0.05)，跨越平台次数增加(P＜0.05)。

2.2 地黄饮子对慢性脑低灌注大鼠海马组织MMP-2、MMP-9的影响 见表2。

表2 地黄饮子对慢性脑低灌注大鼠海马组织MMP-2、MMP-9的影响±s

表2 地黄饮子对慢性脑低灌注大鼠海马组织MMP-2、MMP-9的影响±s

与假手术组比较，*P ＜0.01;与模型对照组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;与地黄饮子小剂量组比较，#P ＜0.05;与地黄饮子大剂量组比较，☆P ＜0.05

MMP-2 MMP-9假手术组 10 —组 别 n剂量(g/kg)2.92 ±0.79 2.25 ±0.87模型对照组 10 — 21.33±2.10* 21.58±2.11*地黄饮子小剂量组 10 10 19.58±2.50△ 19.75±1.76△地黄饮子大剂量组 10 20 17.67 ±1.92△△# 17.92 ±2.47△△#养血清脑颗粒组 10 2 15.75±2.01△△☆ 16.42±2.07△△☆

由表2可见，模型对照组海马组织MMP-2、MMP-9表达较假手术组增高 (P＜0.01)。地黄饮子组、养血清脑颗粒组海马组织MMP-2、MMP-9表达均低于模型对照组(P＜0.05，P＜0.01)。地黄饮子大剂量组海马组织MMP-2、MMP-9表达低于地黄饮子小剂量组(P＜0.05)。养血清脑颗粒组海马组织MMP-2、MMP-9表达低于地黄饮子大剂量组(P＜0.05)。

3 讨论

全脑或局部脑区慢性低灌注是目前认为有认知功能障碍的老年人中比较常见的一种病理生理改变。很多资料显示在低灌注状态下，认知功能可发生减退［1］。有学者永久性结扎大鼠双侧颈总动脉制作出慢性脑缺血的动物模型，经证实这一模型能使Wistar大鼠术后数月脑血流仍明显下降，不同脑区脑血流下降的程度不同。同时，由于大鼠Willis环发达，代偿好，并没有导致任何一个脑区血流灌注完全停止，接近临床慢性脑低灌注的发病机制，是目前普遍认同的用于慢性脑低灌注研究的动物模型［2］。海马、前额叶、颞叶及大脑皮层的神经元对缺血十分敏感，而这些区域神经元功能和结构的损害会造成与学习记忆相关的神经递质紊乱［3］。基质金属蛋白酶(MMPs)是一组钙离子和锌离子依赖的金属蛋白内切酶家族，可以降解绝大部分细胞外基质(ECM)成分［4］。近年来，研究发现MMPs，尤其是MMP-9可以通过降解血脑屏障基底膜及紧密连接，参与脑缺血后血脑屏障的破坏［5］。血脑屏障的功能损害，不仅使水、电解质外流，也使大量的蛋白质外流，最终形成血管源性脑水肿，神经元损坏。同时活化的白细胞通过破坏了的血脑屏障渗出到脑组织内，释放许多细胞因子、炎症介质，加速神经元的死亡，加重缺血性脑损害［6］。另外，目前有研究表明MMP-9还与细胞凋亡有关［7］。

地黄饮子出自《黄帝素问宣明论方》，由熟地黄、巴戟天、山茱萸、石斛、肉苁蓉、五味子等组成，具有滋肾阴、补肾阳、化痰开窍的功能。本研究结果表明，双侧颈总动脉永久性结扎可导致脑低灌注大鼠学习记忆能力减退，炎性介质的释放，加速细胞凋亡。本实验提示地黄饮子能明显改善慢性脑低灌注大鼠学习记忆能力，减低慢性脑低灌注大鼠MMP-2、MMP-9的表达。提示地黄饮子具有一定保护神经元免受损伤，从而预防改善记忆减退的作用。此机制可阐释该方的滋肾阴、补肾阳、化痰开窍的功效。本实验同时发现在减低MMP-2、MMP-9的表达上地黄饮子大、小剂量组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，说明在改善慢性脑低灌注大鼠学习记忆能力、减低慢性脑低灌注上可能存在量效关系，且影响是多方面的。养血清脑颗粒是以宋代《太平惠民和剂局方》的四物汤为基础加味并采用最新工艺研制而成的标本兼治的制剂，在临床上广泛应用于因慢性脑供血不足(CCCI)引起的头晕、头痛等，故本实验选用养血清脑颗粒作为阳性对照药物，本实验中将养血清脑颗粒组与地黄饮子大剂量组进行比较，发现两者之间差异有统计学意义(P＜0.05)，养血清脑颗粒组优于地黄饮子原方组，说明在临床应用上地黄饮子原方应进一步改进研究，以待提高。

［1］毛玲，查运红，黄敬，等.慢性全脑低灌注大鼠血脑屏障的改变及MMP-9表达的实验研究［J］.卒中与神经疾病，2007，14(1):32-36.

［2］赵玲，刘丽，李雅莉，等.慢性脑低灌注状态对大鼠学习记忆功能及脑组织自由基代谢的影响［J］.中国行为医学科学，2005，14(11):961-963.

［3］刘汇波，叶翠飞，李斌，等.双侧颈总动脉结扎对大鼠学习记忆功能和海马组织形态学的影响［J］.基础医学与临床，1998，18(4):54-58.

［4］肖智勇，陈劲草，于加省.基质金属蛋白酶-9和血管内皮生长因子在颅内动脉瘤中的表达［J］.卒中与神经疾病，2006，13(2):90-92.

［5］王静云，王国峰，赵仁亮.脑缺血预处理对脑缺血再灌注大鼠血脑屏障通透性和基质金属蛋白酶-9表达的影响［J］.国际脑血管病杂志，2010，(9):668-673.

［6］毛玲，查运红.基质金属蛋白酶-9与脑缺血血脑屏障损伤的关系［J］.国际神经病学神经外科学杂志，2006，33(1):96-98.

［7］王知非，廖达光，吴浩，等.大鼠弥漫性脑损伤中基质金属蛋白酶-9通过激活钙蛋白酶导致细胞凋亡［J］.中国现代医学杂志，2010，(9):1336-1338.

Effect of Dihuangyinzi on learning and memory and MMP-2，MMP-9 of hippocampal matrix in rats with chronic cerebral hypoperfusion

LI Ruijie*，BAI Liming，ZHANG Xiaoshuang.*Department of Stroke，Xinle City Hospital of Hebei Province，Hebei Province，Xinle050700

ObjectiveTo observe the effect of Dihuangyinzi on learning and memory and MMP-2，MMP-9 of hippocampal matrix in rats with chronic cerebral hypoperfusion.MethodsFifty SD rats were randomly divided into sham operation group，model control group，Dihuangyinzi high-dose group，low-dose group Dihuangyinzi and Yangxueqingnao granule group(n=10).Rat model of chronic cerebral ischemia was established by the method of bilateral carotid artery ligation.Sham group

the same separation of bilateral common carotid artery，but not ligation，Dihuangyinzi high-，low-dose group were given 20，10 g/kg by gavage once a day，dose volume of 10 mL/kg.Yangxueqingnao granule received 2 g/kg，for 8 weeks.Sham operation group and model control group was given an equal volume of distilled water.Learning and memory function in rats were measured by Morris water maze.ResultsEscape latency of model control group was longer than that in the sham operation group(P＜0.05)，frequency of cross-platform was less than that in the sham group(P＜0.05).Escape latency in Dihuangyinzi highdose group，Dihuangyinzi low-dose group and Yangx-ueqingnao granule group were decreased in comparison with that in model control group(P＜0.05，P＜0.01).The frequency of cross-platform in these three groups were increased(P＜0.05，P＜0.01).Escape latency in Dihuangyinzi high-dose group and Yangxueqingnao granule group were decreased in comparison with that in low-dose group Dihuangyinzi group(P＜0.05).The frequency of cross-platform in these two groups were increased compared with that in Dihuangyinzi low-dose group(P＜0.05).MMP-2 and MMP-9 expression of hippocampus in model control group were increased in comparison with those in sham group(P＜0.01).MMP-2 and MMP-9 expression of hippocampus in Dihuangyinzi high-dose group，Dihuangyinzi low-dose group and Yangxueqingnao granule group were lower than those in model control group(P＜0.05，P＜0.01).MMP-2 and MMP-9 expression of hippocampus in Dihuangyinzi high-dose group and Yangxueqingnao granule group were lower than those in Dihuangyinzi low-dose group(P＜0.05).MMP-2 and MMP-9 expression of hippocampus in Yangxueqingnao granule group were lower than those in Dihuangyinzi high-dose group(P＜0.05).ConclusionDihuangyinzi can improve learning and memory in rat with chronic cerebral hypoperfusion，it may be related to inhibition of inflammation and apoptosis.

Rat;SD;Hippocampus;Chemistry;Disease model;Animal;Intracranial arteriovenous malformation;Metabolism;Chronic disease;Cerebral ischemia;Reperfusion injury;Matrix metalloproteinase

R289.5;R-331;R743.4;R977.6

A

1002-2619(2011)10-1551-04

※项目来源:陕西省教育厅科学研究计划(2010JK488);陕西中医学院校级课题(2009XJ-26);陕西省痰瘀论治中医脑病重点研究室重点项目

1 陕西中医学院临床医学院临床教研室，陕西 咸阳 712046

2 陕西中医学院药理教研室，陕西 咸阳 712046

李瑞杰(1979—)，男，主治中医师，硕士。从事中西医结合治疗脑血管病临床和实验研究工作。

2011-06-20)