酶法提取黑木耳多糖的纯化与鉴定

李福利,张丽娟,于国萍*

(1.黑龙江省森林工程与环境研究所,哈尔滨 150040;2.东北农业大学,哈尔滨 150030)

黑木耳不但是营养价值很高的食用菌,而且是药用价值较高的、世界公认的保健品[1]。黑木耳多糖具有抗肿瘤、抗溃疡、增强机体免疫力、促进核酸的生物合成等方面的作用[2]。对于食用菌多糖的提取以往主要采用发酵法、热水浸提法、酸碱浸提法和盐析法为主[3],2005年,张丽娟等研究表明[4],采用复合酶(由纤维素酶、果胶酶和蛋白酶按一定比例组成)提取黑木耳中多糖物质,提取率明显高于水浸提及酸碱浸提,且条件温和,杂质易除,同时对酶法提取条件进行了优化及脱蛋白工艺的探讨[5],得到了黑木耳多糖粗品。本文就此基础上,对黑木耳的有效成分之一——黑木耳多糖进行了初步的纯化与组成确定。

1 材料与方法

1.1 实验材料

黑木耳:中国龙江森林工业集团总公司生产(黑森牌);纤维素酶(4万酶活/g):天津利华酶制剂有限公司);果胶酶(2万酶活/g):天津利华酶制剂有限公司;木瓜蛋白酶(25万酶活/g):丹麦诺维信公司;透析袋:8000-12000,购于海浪科技有限公司;SephadexG-200、SepharoseA-200:购于海浪科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黑木耳多糖粗品的制备

按照文献[4]制得黑木耳多糖提取液,提取液浓缩,再经过无水乙醇沉淀得到絮状黑木耳多糖沉淀,然后将沉淀复溶于水中,浓缩溶液至一定体积,冻干,得到黑木耳多糖粗品,为淡黄色絮状。

1.2.2 黑木耳多糖的纯化

1.2.2.1 改进Sevag法去除蛋白质。将得到黑木耳多糖粗品复溶于水中,用改进Sevag法去除蛋白质[5],得到黑木耳粗多糖。

1.2.2.2 Sephadex G-200凝胶层析。用Sevag法脱除蛋白质的黑木耳粗多糖,再次用无水乙醇沉淀,取沉淀多糖复溶于水中,使其终浓度约为20mg/mL,取4mL上样于事先用0.1mol/L NaCl溶液平衡好的SephadexG-200凝胶柱(2.0cm×40cm)中,用0.1mol/L NaCl溶液洗脱,控制流速为20mL/h,每管收集4mL,苯酚-硫酸法跟踪检测,作洗脱曲线。收集多糖峰组分,透析、浓缩、冷冻干燥后得到白色黑木耳多糖粉末。

1.2.3 黑木耳多糖的纯度鉴定

1.2.3.1 SepharoseA-200凝胶层析。取纯化后,透析,浓缩得到的黑木耳多糖溶液AAP1和AAP2,使其终浓度约为 20mg/mL,上样于用0.1mol/L NaCl溶液平衡好的 Sepharose A-200层析柱(2.0cm×40cm)中,用0.1mol/L NaCl溶液洗脱,控制流速为20mL/h,每管收集4mL,分部收集,苯酚-硫酸法跟踪检测,作洗脱曲线。

1.2.3.2 紫外光谱扫描。将纯化后的多糖收集液,透析,浓缩,冻干得到的黑木耳多糖纯品溶解后作紫外光谱扫描,观察光谱扫描结果。

1.2.3.3 黑木耳多糖的官能团分析

1.2.3.4 外光谱扫描。冻干得到的黑木耳多糖纯品,做红外光谱扫描。

1.2.4 层析黑木耳多糖的组分分析

合并柱层析得到的黑木耳多糖收集液的多糖峰组分,透析、浓缩冻干得到黑木耳多糖纯品,然后溶于5mL 2mol/L硫酸中,密封后置于100℃恒温水浴中水解8h,然后用BaCl2溶液中和,过滤,取滤液浓缩,点样于中华1#层析专用滤纸上,点样量为2μ L,置于层析缸中,展层,展层剂为正丁醇:醋酸:水的混合溶液,其体积比为4∶1∶5。显色剂为苯胺-邻苯二甲酸溶液。喷雾显色后,于105℃加热5min,观察层析结果。

1.2.5 多糖含量的测定

总糖测定采用苯酚-硫酸法,还原糖测定采用DNS法[6]。多糖含量=总糖量—还原糖量。

2 结果与讨论

2.1 Sephadex G-200凝胶层析

黑木耳多糖提取液经过无水乙醇沉淀,Sevag法去除蛋白质,透析,浓缩再次醇沉后得到絮状黑木耳多糖沉淀,取沉淀多糖配成配成20mg/mL的多糖溶液,上样于 Sephadex G-200凝胶柱中,用0.1mol/L NaCl溶液洗脱,分步收集,用苯酚-硫酸法跟踪检测,作出洗脱曲线,结果见图1。

图1 黑木耳多糖Sephadex G-200凝胶层析图谱

由图1可以看出,黑木耳多糖含有两种组分,分别用AAP1、AAP2表示,其中主要成分是AAP1,合并相同洗脱峰,即收集19～38管为AAP1,收集39～55管为AAP2。经过透析,浓缩,冷冻干燥,即得到黑木耳多糖纯品,为白色粉末状物质。

2.2 黑木耳多糖的Sepharose A-200凝胶层析纯度鉴定

纯化后的黑木耳多糖收集液AAP1和AAP2,浓缩后,取4mL上样于0.1mol/L NaCl溶液平衡好的Sepharose A-200凝胶柱中,然后用0.1mol/L NaCl溶液洗脱,控制流速为20mL/h,分步收集,每管收集4mL,苯酚-硫酸法跟踪检测,做出洗脱曲线。实验结果见图2和图3。

图2 黑木耳多糖AAP1的纯度鉴定

图3 黑木耳多糖AAP2的纯度鉴定

由图可以看出黑木耳多糖AAP1,AAP2均为单一对称洗脱峰,说明黑木耳多糖样品中的两种组分纯度很高,符合物理化学分析标准。

2.3 紫外光谱扫描

将冻干得到的黑木耳多糖纯品AAP1,溶解于水中作紫外光谱扫描,扫描结果见图4。

图4 紫外光谱扫描图

由图4可知,在260nm和280nm处无吸收峰,即黑木耳多糖样品中不含有核酸、多肽和蛋白质物质。

2.4 黑木耳多糖的红外光谱扫描官能团分析

分析结果见图5所示,在4000～650cm-1呈多糖类物质的特征吸收峰。3500～3000cm-1的尖峰是O-H的伸缩振动引起的,在3000～2800cm-1之间的尖峰是由糖类C-H的伸缩振动引起的,1450～1120cm-1的峰是C-H的变角振动,这两组峰是糖类的特征吸收峰;在1127cm-1附近微弱的吸收峰是吡喃糖β-型C-H变角振动的吸收峰,1629cm-1附近的吸收峰是糖的水化物,因此推断该木耳多糖为一种β-吡喃多糖。

图5 红外光谱扫描

2.5 纸层析法黑木耳多糖的组分分析

合并经过凝胶柱层析纯化后的多糖收集液AAP1,透析除去盐离子,然后浓缩、冻干得到白色黑木耳多糖纯品,溶于2mol/L硫酸中,密封,置于100℃水浴中水解8h,然后用BaCl2溶液中和,过滤去除沉淀,浓缩,点样于中华1#层析专用滤纸,用展层剂展开,喷雾显色后,结果见图6。由纸层析图谱可以看出,AAP中含有葡萄糖

图6 AAP水解物的纸层析图谱

(Glu)、木糖(Xyl)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、阿拉伯糖(Arb),Rf相对比值为Glc∶Xyl∶Gal∶Man∶

Arb=1∶1.32∶0.88∶1.06∶1.18。说明黑木耳多糖是一种杂多糖。

3 结论

3.1 利用优化改进的Sevag法可以很好的脱除黑木耳多糖粗品中的蛋白质。

3.2 Sephadex G-200可以用来分离纯化黑木耳多糖,获得 AAP1和 AAP2黑木耳纯多糖两个组分,其中AAP1为主要组分。

3.3 黑木耳纯多糖的纯度鉴定:Sepharose A-200凝胶柱层析洗脱后得到单一对称洗脱峰;紫外光谱扫描在260nm和280nm处没有吸收峰,说明不含核酸、多肽和蛋白质物质。

3.4 红外光谱扫描的结果表明,在3500～3000 cm-1之间的峰是O-H的伸缩振动引起的,3000～2800cm-1和1500～1100cm-1之间的吸收分别是C-H的伸缩振动和变角振动,是多糖类物质的特征吸收峰,推断该木耳多糖为一种β-吡喃多糖。

3.5 纸层析结果表明,黑木耳多糖由葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖5种单糖组成,说明黑木耳多糖是一种杂多糖。

[1]陈和生,孙振亚.黑木耳多糖的研究进展[J].时珍国医国药,2003,14(5):300-301.

[2]张秀娟,季宇彬.黑木耳多糖药理学研究进展[J].中国微生态学杂志,2003,15(6):373-374.

[3]陈艳秋,周丽萍.而木耳子实体水溶性多糖提取工艺的研究[J].吉林农业大学学报,2003,25(4):470-472.

[4]张立娟,于国萍,周国华.黑木耳多糖酶法提取条件的研究[J].食品研究与开发,2005,26(3):89-91.

[5]张立娟,于国萍.黑木耳多糖酶法提取条件的优化及脱蛋白工艺的研究[J].食品工业科技,2005(5):109-111.

[6]张维杰.复合多糖生化研究技术[M].上海:上海科学技术出版社,1987.