S100A4基因在不同骨肉瘤细胞和组织中的表达

马 旭，王岩峰，安贵峰，商冠宁，吕 刚

(1.沈阳市骨科医院，辽宁 沈阳 110044；2.中国医科大学 附属第一医院 骨科，辽宁 沈阳 110001)

骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤，恶性度高，预后差，易发生远处转移。近年来的研究表明，S100A4基因和蛋白的异常表达与恶性肿瘤的生物学行为密切相关，特别在肿瘤的侵袭和转移中发挥着重要的作用。S100A4有可能成为一种能够预测肿瘤病情发展及指导临床治疗的指标。本研究检测S100A4基因在不同的人骨肉瘤细胞系和骨肉瘤组织中的表达情况，并分析其临床意义。

1 材料和方法

1.1 实验对象

人骨肉瘤细胞系MG-63及U-2OS购自中科院上海细胞研究所。骨肉瘤组织选取中国医科大学附属第一医院2004-2008年收治的骨肉瘤病例33例，对照组选取中国医科大学附属第一医院2008年收治的骨软骨瘤病例13例。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：细胞培养条件：37 ℃, 5 % CO2，DMEM/HIGH Glucose培养基+10 %标准胎牛血清。

1.2.2 细胞总RNA提取和Real-time PCR反应：使用Trizol试剂提取细胞总RNA并进行逆转录反应。Real-time PCR反应引物序列，目的基因S100A4：5'-GCCCTGGATGTGATGGTG-3'(上游)，5'-CGTTGTCCCTGTTGCTGT-3'(下游)，扩增产物184 bp；内参照β-actin：5'-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'(上游)，5'-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3'(下游)，扩增产物150 bp。使用SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)(TaKaRa)进行Real-time PCR反应。反应条件：95 ℃，5 s(1次)；95 ℃，5 s；56 ℃，20 s；68 ℃，15 s(循环45次)。取PCR反应产物5 μL于含0. 5 μg/mL EB的2 %琼脂糖凝胶电泳检测结果。

1.2.3 SP法免疫组化染色：石蜡切片，3 μm厚，脱蜡水化后进行免疫组化染色。用枸缘酸盐缓冲液(pH 6.0)高温修复抗原；用3 %过氧化氢室温孵育10 min阻断内源性过氧化氢酶的活性；正常山羊血清室温封闭10 min；加入1∶100稀释的兔抗人S100A4多克隆抗体(NeoMarkers)/鼠抗人CD44V6单克隆抗体(Maixin)后，37 ℃温箱孵育150 min；滴加适当生物素化二抗工作液，37 ℃孵育20 min；滴加S-P液(ZYMED)，37 ℃孵育20 min；最后DAB显色，苏木素复染5 min，1 %盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗反蓝；切片经过梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。以PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)替代一抗作为阴性对照。

1.3 判断标准

S100A4蛋白阳性表达的位置在骨肉瘤细胞的细胞浆，CD44V6蛋白阳性表达的位置在骨肉瘤细胞的细胞膜和近膜的胞浆，阳性细胞着色呈不同程度的黄色。每张切片分别计数5个不连续的高倍视野，计算平均阳性细胞数所占的百分比。按染色程度将阳性信号分为3 类：淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。染色强度×阳性细胞百分数为每例组织染色的综合记分。阳性表达为综合记分≥1，阴性表达为<1。

1.4 统计学方法

所有数据均使用SPSS11.0统计学软件处理，采用t检验进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞培养

MG-63人骨肉瘤细胞呈圆形、多角形和梭形等多种形态。传代后3 h左右即可见细胞相继贴壁生长，8 h后细胞逐渐伸出胞突，变为多角形或不规则形， 24 h后见有较多新分裂的细胞附着于集落表面，核仁多个，为圆形或不规则形。U-2OS人骨肉瘤细胞呈圆形、扁平不规则多角形和短梭形等多种形态，中央有圆形核，上皮型细胞形态明显。细胞的体积小于MG-63细胞，细胞贴壁生长，细胞数量达饱和密度后，细胞彼此紧密相连成单层膜状。

2.2 Real-time PCR反应结果

Real-time PCR反应结果显示，人骨肉瘤细胞系MG-63及U-2OS中均有S100A4基因表达。用琼脂糖凝胶电泳定性检测PCR产物。显示骨肉瘤细胞系MG-63及U-2OS中均有100～250 bp之间的清晰条带，表达程度接近；同时扩增两种骨肉瘤细胞系的管家基因β-actin，表达程度也相近，片段小于S100A4基因。由于扩增的S100A4基因为184 bp的片断，且骨肉瘤细胞系MG-63及U-2OS中均有100～250 bp之间的清晰条带(图1)，两种细胞系均有S100A4基因的表达。管家基因β-actin的扩增片段的大小是150 bp，并且在各种细胞中表达程度相似。

2.3 免疫组织化学染色结果

S100A4蛋白在骨肉瘤组织中表达的阳性率是69.7%，阳性表达的位置在骨肉瘤细胞的细胞浆，呈棕褐色颗粒状阳性反应(图2a)，对照组未见S100A4蛋白表达。CD44V6蛋白阳性表达的位置在骨肉瘤和骨软骨瘤细胞的细胞膜和近膜的胞浆，呈棕黄色阳性反应(图2b、c)，在骨肉瘤组织中表达的阳性率是60.6%，在骨软骨瘤中的阳性率仅为7.7%。

图1 Real-time PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图

2.4 S100A4蛋白与CD44V6蛋白表达的关系

本实验检测的骨肉瘤组织中S100A4和CD44V6蛋白的表达有一致性，经配对样本t检验分析显示S100A4和CD44V6蛋白的表达具有正相关性(r=0.413，P<0.05，表1)。

图2 S100A4和CD44V6蛋白在骨肉瘤组织中的的表达 SP ×400

表1 S100A4和CD44V6蛋白在骨肉瘤中表达的关系

3 讨 论

骨肉瘤是临床常见的成骨性恶性肿瘤，约占所有骨肿瘤的20 %，其恶性程度高，好发于青少年，易复发和转移，预后较差。随着分子生物学理论和技术水平的提高，尤其是肿瘤分子生物学的发展，人们对骨肉瘤的发生机制在分子水平上有了新的认识。近年来的研究表明，S100A4基因和蛋白的异常表达与恶性肿瘤的生物学行为密切相关，特别在肿瘤的侵袭和转移中发挥着重要的作用[1-2]。有关S100A4蛋白与多种肿瘤生物学特性的研究已相继开展。

S100A4基因是1989年由Sbralidze从高转移性小鼠乳癌细胞中克隆出来的一种转移相关基因[3]。1992年克隆了人类S100A4基因。该基因位于染色体1q21，基因全长2837 bp，编码101个氨基酸的蛋白。该区易发生各种染色体的缺失、易位、重叠等改变，提示S100A4基因与肿瘤的发生发展关系密切[4]。关于S100A4基因与肿瘤发展的分子机制的最初证据来源于对具有转移性的鼠细胞系SR-3Y1的观察[5]。其后的转染实验显示,啮齿动物及人类的S100A4可以诱导无转移性的大鼠乳腺癌细胞系出现转移征象[6]。与此相似的，将啮齿动物S100A4基因转染入鼠类恶性黑素瘤细胞系B16和人类乳腺癌细胞系MCF7增加了其向肺脏转移的能力[7]。上述研究揭示了S100A4基因与肿瘤侵袭转移行为之间的关系，验证了S100A4基因的促肿瘤转移作用。

本研究发现在人骨肉瘤细胞系MG-63及U-2OS中，均有S100A4基因的表达，mRNA的含量相近，说明S100A4基因在不同人骨肉瘤细胞系MG-63及U-2OS中的表达程度相近。因此，推测S100A4基因与骨肉瘤侵袭、转移密切相关，为进一步的研究提供了依据。

CD44(cluster of differentiation 44)是1980年被发现并确认，由单一基因编码的具有高度异质性的单链膜表面糖蛋白家族，可与多种配体结合，介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的粘附作用[8]。人类CD44基因定位于11号染色体短臂(11p13)，长50～60 kb，由两组外显子(1～20)组成。一组编码普遍表达的标准型CD44s；另一组称为变异体CD44V。含有变异型外显子V6编码序列的CD44分子，即为CD44V6，与人类肿瘤关系密切。研究表明，CD44V6在多种肿瘤细胞表达上调或发生构型改变 ，即在肿瘤组织中呈高表达，而在正常组织中呈低表达或不表达。临床研究发现[9-10]，CD44V6的过量表达与骨肉瘤、乳腺癌、胃肠道肿瘤、子宫颈癌和淋巴瘤等恶性肿瘤的发生发展，侵袭转移以及手术后生存期长短密切相关。Shiratori等[11]对骨肉瘤细胞株(POS-1)转染的20只鼠肺转移情况研究证实，CD44V6的上调能促进肺转移；Khan等[12]的研究也证实，上调肿瘤细胞表面CD44V6的表达，能显著增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力。

在本研究中，S100A4和CD44V6蛋白在选取的骨肉瘤组织中均有比较高的表达，而在对照组骨软骨瘤中没有表达或仅有少量的表达。据此可推测，骨肉瘤的发生发展与S100A4和CD44V6蛋白的异常表达有密切的关系。S100A4蛋白可以降低肿瘤细胞间粘附力、增加肿瘤细胞的运动能力、重塑细胞外基质、抑制细胞凋亡、促进细胞异常增生和促进新生血管生成。而CD44V6蛋白通过下面几种方式影响肿瘤细胞：介导淋巴细胞与毛细血管或小静脉中的高内皮细胞结合，使淋巴细胞穿过血管壁，并参与淋巴细胞的激活过程；与细胞外基质中的透明质酸、胶原蛋白、纤维蛋白、层黏蛋白等基质结合；与细胞骨架蛋白结合参与细胞伪足形成而参与细胞的迁移运动。本研究还发现，检测的骨肉瘤组织中S100A4和CD44V6蛋白的表达具有正相关性，提示S100A4和CD44V6的表达可能有内在联系。由此推测，S100A4和CD44V6可能通过对细胞外基质的调节作用而发生相互影响，降低细胞间粘附力，促进肿瘤细胞的侵袭和转移。通过调控这些基因的表达，可能使骨肉瘤的生长、转移受到抑制，为骨肉瘤的治疗提供了新的思路。

参考文献：

[1] Boye K,Maelandsmo GM. S100A4 and metastasis: a small actor playing many roles [J]. Am J Pathol, 2010, 176 (2): 528-535.

[2] Shebet GV. Metastasis promoter S100A4 is a potentially valuable molecular target for cancer therapy [J]. Cancer Lett, 2009, 280(1):15-30.

[3] Rosty C, Ueki T, Argani P, et al. Over expression of S100A4 in pancreatic ductal adenocar- cinomas is associated with poor differentiation and DNA hypomethylation [J]. Am J Pathol, 2002, 160 (1): 45-50.

[4] Davies BR, O'Donnell M, Durkan GC, et al. Expression of S100A4 protein is associated with metastasis and reduced survival in human bladder cancer [J]. J Pathol, 2002, 196 (3): 292-299.

[5] Levett D, Flecknell PA, Rudland PS, et al. Transfection of S100A4 produces metastatic variants of an orthotopic model of bladder cancer [J]. Am J Pathol, 2002, 160 (2): 693-700.

[6] Kohya N, Kitajima Y, Jiao W, et al. Effects of E-cadherin transfection on gene expression of a gallbladder carcinoma cell line: repression of MTS1/S100A4 gene expression [J]. Int J Cancer, 2003, 104: 44-53.

[7] Andersen K, Nesland JM, Holm R, et al. Expression of S100A4combined with reduced E-cadherin expression predicts patient outcome in malignant melanoma [J]. Mod Pathol, 2004, 17 (8): 990-997.

[8] Tanaka S.Targeting CD44 in mast cell regulation [J]. Expert Opin Ther Targets, 2010, 14 (1): 31-43.

[9] Forst B,Hansen MT,Klinqelhofer J, et al. Metastasis-inducing S100A4 and RANTES cooperate in promoting tumor progression in mice [J]. PLos One, 2010, 5(4): e10374.

[10] Jeon CH,Kim HL,Park JH. Induction of S100A4, S100A6, and galectin-1 during the lineage commitment of CD4+CD8+thymocyte cell line is suppressed by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin [J]. Toxicol Lett,2009, 187(3): 157-163.

[11] Shiratori H, Koshino T, Uesugi M, et al. Acceleration of lung metastasis by up-regulation of CD44 expression in osteosarcoma-derived cell transplanted mice [J]．Cancer Lett, 2001, 170(2): 177-182.

[12] Khan SA，Cook AC，Kappil M，et al. Enhanced cell surface CD44 variant (v6, v9) expression by osteopontin in breast cancer epithelial cells facilitates tumor cell migration: novel post-transcriptional, post-translational regulation [J]．Clin Exp Metastasis, 2005, 22(8): 663-673.