高效液相色谱法测定常见药物中的亚硝酸盐含量

黄丽华，许湃彬

1.长沙市妇幼保健院药剂科，湖南长沙 410007；2.中南大学湘雅二医院药剂科，湖南长沙 410011

亚硝酸盐具有保鲜、防腐、使用后颜色鲜艳等功效，是很多药物的添加剂；但是过量有严重的毒性，是致癌物质N-亚硝胺的重要前体[1]。随着人们环境意识和药物安全意识的加强，亚硝酸根成为药物分析的重要项目[2]。近年来，国内外已报道的测定亚硝酸盐的方法很多，其中分光光度检测法和电化学检测法操作简单，设备成本低，可作为教学与实用性检测手段，但检出限高、灵敏度与特异性较低[3-4]。高效液相色谱灵敏度高，检出限低，特异性高，适于分析常见药物中的微量亚硝酸钠含量[5]。本实验利用经过优化色谱和衍生化条件，测定常见药物中的亚硝酸盐，效果较好，现总结报道如下：

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪Agilent 100（美国安捷伦科技有限公司），HPI 100荧光检测器 （美国惠普科技有限公司），AE260S电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司），搅碎机（上海生物工程器械制造有限公司），Milli-Q50高纯水处理器（日本日立公司）。

1.2 标准液的制备

将亚硝酸钠试剂置于100℃烘箱中烘烤24 h，准确称取0.01 g于50 ml的烧杯中，滴入0.5 ml氢氧化钠，0.1 ml三氯甲烷，双蒸水溶解然后转移至500 ml的容量瓶中，最后用双蒸水定容至刻度，浓度为20μg/ml（标准储备液）。亚硝酸钠标准工作液：准确吸取上述标准储备液2 ml，置于100 ml容量瓶中，双蒸水定容至刻度，该使用液亚硝酸钠浓度为 0.4 μg/ml。

1.3 样品处理

准确称取药物均质试样5.0 g，置于50 ml烧杯中，加入35 ml的蒸馏水，使用玻璃棒混匀，静置10 min后再加入1 mol/L NaOH溶液1 ml，1.1 mol/L乙酸锌溶液1 ml混匀静置10 min。

1.4 色谱条件

流动相 V（双蒸水）∶V（乙腈）=60∶40；高效液相检测波长：激发波长375 nm，发射波长415 nm；流速：0.8 ml/min；进样量：10 μl；进样方式：自动式进样；柱温：50℃。

1.5 分析方法

定性依据：取高中低三个浓度梯度的亚硝酸钠标准工作液，经DNA衍生化反应后，响应值与浓度成比例增长的色谱峰为目标化合物色谱峰，在相同的实验条件下，样品测试液中色谱峰与亚硝酸钠标准工作液的色谱峰保留时间一致，可判定为样品测试液中含有目标化合物。

2 结果

2.1 标准曲线的制备

分别吸取浓度为20μg/ml亚硝酸钠标准储备液0.025、0.050、0.100 ml于1 000 ml容量瓶定容至刻度；另分别吸取亚硝酸钠标准储备液 0.5、1.0、2.0、2.5 ml于250 ml容量瓶定容至刻度。 得到浓度分别为 0.000 5、0.001、0.002、0.04、0.08、0.16、0.20μg/ml，按前述条件衍生化反应后进行色谱测定，由数据得出标准曲线，在浓度为0.000 5~0.299μg/ml呈良好的线性关系，回归方程为Y=4 520.2X，相关系数，r=0.999 9。

2.2 回收率与精密度的测定

取阿莫西林、头孢曲松钠、头孢唑肟钠三种样品做回收试验。见表1。

3 讨论

亚硝酸钠是一种良好的食品与药物添加剂，不仅能防腐、保鲜，还能抑制肉毒杆菌的繁殖；但亚硝酸钠也有极大的危害性，其含量于人体血液中0.4~200.0 mg/kg时会产生毒性，使人体内正常血红蛋白转变成高铁血红蛋白，从而失去携氧功能，还能与人体中的二级胺或三级胺结合转化成强烈致癌物质——亚硝胺从而诱发癌变[6]，危害相当大。亚硝酸钠在药物中的普遍微量存在使检测工作面临极大挑战，当前亟需建立一种高效、灵敏、省时省力、成本低的检测方法。亚硝酸钠的检测方法主要有分光光度计法、电化学检测法、气相-质谱联用法、毛细管电泳法等[7]。其中一些虽然操作简单、费用较低，但灵敏度不高；还有一些方法检测限低，但仪器设备过于昂贵[8]。

表1 亚硝酸钠在药物中的平均加标回收率和精密度（n=6）

本文建立了经柱前衍生化高效液相色谱法荧光检测水产品中的亚硝酸钠的方法。实验过程采用微量化操作，所用试剂成本较低，前处理方法简单，避免了离子干扰。通过改进色谱条件，优化亚硝酸钠与衍生化条件，色谱分离更好。最低检出限为0.01 mg/kg，甚至更低，解决了以往分光光度计法检测灵敏度低的状况，回收率在85.6%~95.5%之间，方法平均相对标准偏差在1.4%~2.6%之间，在0.000 5~0.299μg/ml范围内线性关系良好，r=0.999 9，此方法也适合于其他药物中亚硝酸钠的检测。

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