同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病大鼠的实验研究

高 斌 ，宓 真，杜馨丽，车海龙

辽宁省糖尿病治疗中心，辽宁沈阳 110015

糖尿病仍属终身疾病，传统药物治疗难以阻止胰岛β细 胞进行性衰竭，患者终身依靠胰岛素治疗亦不能阻止并发症的进展。近年来的细胞移植治疗，使得根治糖尿病有了新的曙光。骨髓间充质干细胞（BMSC）能定向诱导分化为胰岛素分泌细胞，易于获得及体外扩增，可以解决临床胰岛细胞供体缺乏难题，并且避免移植物免疫排斥反应、涉及的医学伦理学及法律问题[1]。但该研究尚处于初期阶段，仍有许多问题需要解决，本研究通过SD大鼠尾静脉注射重组腺病毒-绿色荧光蛋白（Ad-GFP）病毒感染的BMSC，从生化检测、病理及免疫组织化学观察等方面初步探讨了同种异体BMSC移植对糖尿病大鼠的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

1.1.1 实验动物 SD大鼠 （清洁级），24只， 体重150～200g，2个月龄，室温18～25℃，自然光照射，购自沈阳药科大学动物实验室。

1.1.2 主要试剂 链脲佐菌素（streptozotocin，STZ；美国 sigma公司产品），DMEM-F12培养液 （Gibcol）， 胎牛清 （国产天津），Hanks液 （本实验室自己配制），消化液：0.25%胰蛋白酶＋0.02%EDTA 混合液（1∶1）；重组腺病毒 （Ad-GFP 上清）：北京诺赛基因组研究中心有限公司提供，血糖（葡萄糖氧化酶法，德国 BIOSEN C-Line，Clinic），胰岛素（放免试剂盒由北京北方生物技术研究所提供），糖化血红蛋白 （HbA1c）测定：比色法，试剂盒为南京建成生物工程研究所提供。

1.2 实验方法

1.2.1 糖尿病模型建立和分组 大鼠禁食12 h（不禁水），以2%STZ溶液[临用前低温（0℃）以pH=4.2的枸橼酸-枸櫞酸钠缓冲液配成]，45 mg/kg腹腔一次注射。造模后第7天乙醚轻度麻醉下采血（眶静脉）测血糖。选血糖＞16.7 mmol/L 15只大鼠作为实验对象。随机分为实验对照组：血糖（22.27±2.23）mmol/L，n=6；移植组：血糖（22.18±1.94） mmol/L，n=9。 造模前随机抽取的5只正常对照组大鼠腹腔注射等量枸橼酸钠缓冲液。

1.2.2 骨髓液采集制备 正常SD大鼠经20%乌拉坦5～9 ml/kg腹腔注射麻醉，无菌条件下摘取其两侧胫骨和股骨，用Hanks液（添加p 100 U/ml，s 100μg/ml）清洗两遍。用咬骨钳暴露骨髓腔，用注射器吸10 ml含10%胎牛血清DMEM-F12培养液，从骨髓腔冲洗出骨髓液，并收集。

1.2.3 BMSC培养扩增[2]将收获的骨髓打散成为细胞悬液，1 000 r/min离心10 min，用含10%胎牛清DMEM-F12培养基重悬沉淀的细胞，调节细胞密度（3～5）×107接种于培养瓶中，37℃，5%CO2培养箱，100%湿度条件下进行培养。48 h后首次全量换液，72h半量换液。以后每3～4天换液1次。7～10 d当形成一些较大细胞克隆时，用Hanks液清洗培养物2次，加入消化液（0.25%胰蛋白酶＋0.02%EDTA混合液1∶1）数滴，置温箱中消化，镜下观察细胞回缩，间隙增大时，加含10%胎牛血清DMEM-F12培养液停止消化。再按1∶3传代接种到新培养瓶中，传代后继续培养的细胞再达80%～90%融合时，再行消化，获得传2代的BMSC。

1.2.4 GFP病毒感染传代的BMSC[2]将传2代获得的BMSC每孔按2×105数量（2 ml）接种于 6孔板中。培养 72 h后，弃培养基，每孔加入Ad-EGFP的病毒上清并换含10%FBS的DMEM培养基继续培养48 h，倒置荧光显微镜观察细胞转染情况。1.2.5移植方法及相关检测 经筛选稳定表达GFP的BMSC用于移植。移植组大鼠尾静脉注射BMSC悬液0.4 ml，细胞数1×106～1×107/ml。实验对照组及正常对照组大鼠尾静脉注射生理盐水。移植2周后采血测各组血糖、HbA1c、胰岛素，并处死大鼠剖取胰腺，制作石蜡切片进行胰岛素免疫组化及冰冻切片荧光倒置显微镜直接观察GFP表达。

1.3 统计学方法

数据以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 三组大鼠血糖、HbA1c、胰岛素比较

实验2周，实验对照组糖尿病大鼠血糖、HbA1c明显高于正常对照组 （P＜0.001），胰岛素明显低于正常组 （P＜0.001）。移植组血糖、HbA1c低于实验对照组，其中HbA1c差异显著（P＜0.05），胰岛素高于实验对照组（P＞0.05）。 见表 1。

表1 三组大鼠血糖、HbA1c和胰岛素比较（x±s）

2.2 三组病理观察

正常对照组大鼠胰岛形态结构一致，在胰腺腺泡之间可见散在分布的胰岛，圆形或椭圆形,色浅，胰岛细胞呈团索状分布，数量较多。免疫组化结果显示，正常对照组胰岛中心部胰岛细胞的胰岛素为强阳性，细胞内可见深褐色粗大颗粒。实验对照组胰岛及胰岛中心细胞数明显减少。胰岛素反应基本阴性，仅见个别胰岛细胞内出现少量微弱淡黄色的细颗粒。移植组大鼠胰岛中心部细胞增多，大部分胰岛素反应阳性或强阳性呈黄色或褐色颗粒。胰腺外分泌组织可见表达GFP的细胞，胰岛中未发现其表达。

3 讨论

研究证实胰腺移植可有效缓解糖尿病[3]，但由于胰腺和胰岛移植存在供体缺乏、免疫排斥反应等难题，促使学者们将研究重点转移到了能分化成胰岛素分泌细胞的干细胞的研究上。

骨髓来源的干细胞在体外和体内能分化为胰岛素分泌细胞[4]。BMSC能定向诱导分化为胰岛素分泌细胞[5-6]，易于获得及体外扩增，可以解决临床胰岛细胞供体缺乏难题，并且避免移植物免疫排斥反应、涉及的医学伦理学及法律问题。但该研究尚处于初期阶段，仍有许多问题需要解决，如分离纯化问题、尚缺乏行之有效的定向诱导分化方案、移植时机及移植后的安全性问题等。由于诱导方法、条件、移植途径不同，移植后对糖尿病大鼠治疗结论不一[7-8]。BMSC直接移植入糖尿病大鼠体内，能否分化为胰岛β细胞，尚无结论性共识。有研究报道，BMSC移植能降低糖尿病大鼠血糖，升高血胰岛素水平，组织学显示有胰岛再生，植入的BMSC在胰腺微环境发生迁移和再分布，向胰岛β细胞方向分化[9]。

根据干细胞“归巢”特性，BMSC会向病变处定向迁移。本研究采用大鼠骨髓体外贴壁分离培养、扩增方法，获取传2代的BMSC，用GFP标记，经同种异体糖尿病大鼠尾静脉直接移植治疗2周，观察静脉移植BMSC对糖尿病大鼠的作用，移植途径方便。本实验糖尿病模型是用STZ选择性破坏胰岛β细胞，使胰岛素分泌减少，血糖升高。结果显示移植组糖尿病大鼠血糖、HbA1c明显下降，胰岛素产生增加，胰岛中心部细胞增多，大部分胰岛素反应阳性或强阳性呈黄色或褐色颗粒。胰腺外分泌组织可见表达GFP的细胞，但胰岛中未发现其表达，不除外实验手段的因素，关于BMSC在大鼠体内迁移、分化，参与损伤胰岛修复的具体机制有待进一步研究。

本研究提示同种异体BMSC经尾静脉直接移植可发挥有效的治疗作用。与前述研究结果一致，可能通过内源性胰岛细胞增生发挥治疗作用，为糖尿病细胞治疗提供了新的途径。

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