林可霉素-大观霉素复方混悬注射液中有效成分含量的HPLC法测定*

王 忠,王立琦,刘小琴,范惠敏,黄显会,曾振灵

(华南农业大学兽医学院,广东广州 510642)

林可霉素-大观霉素复方混悬注射液中有效成分含量的HPLC法测定*

王 忠,王立琦,刘小琴,范惠敏,黄显会,曾振灵*

(华南农业大学兽医学院,广东广州 510642)

建立了测定林可霉素-大观霉素复方油混悬注射液中盐酸林可霉素与盐酸大观霉素含量的高效液相色谱(HPLC)方法。采用C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μ m),检测林可霉素的流动相为0.05 mol/L硼砂溶液(用850 mL/L磷酸调节 pH 至5.0)-甲醇-乙腈(60∶36∶4),检测波长为214 nm;检测大观霉素的流动相为乙腈-四氢呋喃-水(30∶35∶35),检测波长为415 nm。结果表明,在 10 μg/mL～40μg/mL浓度范围内,林可霉素和大观霉素均呈良好线性关系,二者平均回收率分别为98.68%和99.10%,平均批内变异系数分别为0.93%和0.86%,批间变异系数分别为1.68%和0.98%。本方法操作简便、准确,可用于林可霉素-大观霉素复方油混悬注射液含量的测定。

林可霉素-大观霉素复方油混悬注射液;盐酸林可霉素;盐酸大观霉素;高效液相色谱法;含量测定

*通讯作者

林可霉素与大观霉素合用为兽医临床常用复方,二者配伍有协同作用,对仔猪腹泻、猪的支原体肺炎和鸡慢性呼吸道病具有很好的疗效[1]。其现有的复方剂型有预混剂与可溶性粉[2]。笔者研制的盐酸林可霉素-盐酸大观霉素油混悬注射液振摇易分散,各项质量指标符合药剂学要求。中国兽药典[3]与美国药典[4]检测林可霉素均采用高效液相色谱法(HPLC)。大观霉素极性强,无发色集团,紫外最大吸收波长在190 nm附近,属于末端吸收区,含量分析较为困难[5]。目前,大观霉素含量的测定有微生物法[4]、气相色谱法[6-7]、薄层色谱法[8]、高效液相色谱-电化学检测法(HPLC-ECD)[9-10]、高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)[11-12]、高效液相色谱荧光法[13]、高效液相色谱-串联质谱法[14-15],这些方法或者缺乏特异性,或者对仪器要求较高,对于普通的药物制剂含量的测定而言,成本较高或较复杂。本文采用HPLC法对林可霉素-大观霉素复方混悬注射液中林可霉素和大观霉素的含量进行测定,较之微生物法和气相色谱法简单、经济,为此复方药物的质量控制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 电子分析天平,FA2004N型,为上海精密科学仪器有限公司产品;Dionex U-3000系列液相色谱仪;Dionex U-3000紫外检测器,chromeleon色谱工作站,为美国Dionex公司产品。

1.1.2药品 盐酸林可霉素对照品,含量87.9%,批号:k0100708;大观霉素精制品,含量 99%,批号:S9007,Sigma公司分装。2,4-二硝基苯肼(DNPH)、三氟乙酸(TFA)为化学纯,乙腈、甲醇、四氢呋喃均为色谱纯。

1.2 方法

1.2.1对照品溶液的制备 准确称取盐酸林可霉素对照品适量,加水定容,得到1 mg/mL的标准储备液。准确称取大观霉素精制品适量,加水定容,得到1 mg/mL的标准液,现配现用。

1.2.2 供试品溶液的制备 精密量取林可霉素-大观霉素复方混悬注射液1 mL,加入10 mL超纯水,涡旋,振荡,然后5 000 r/min离心10 min,林可霉素样品取水相用超纯水稀释适当倍数,0.22 μ m滤膜过滤,进行HLPC检测;大观霉素样品稀释适当倍数后取0.15 mL进行衍生化处理。

1.2.3 大观霉素的衍生化 大观霉素衍生化参照文献[16-18]进行。取0.15 mL待测大观霉素样品溶液于2 mL离心管中,加入0.6 mL TFA-乙腈溶液(以乙腈为溶剂,TFA为溶质,浓度为60 g/L)和0.6 mL DNPH-乙腈溶液(以乙腈为溶剂,DNPH为溶质,浓度为5 g/L),涡旋,置于70℃恒温水浴锅中进行衍生化反应1 h,待完成后置于冰块中,待冷却后取出加入0.15 mL丙酮以终止反应,涡旋,然后继续置于70℃恒温水浴锅中加热10 min,取出自然冷却,15 000 r/min离心10 min,过膜后进行H LPC检测。

1.2.4 色谱条件 色谱柱为HypersilBDS C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm,5 μ m)。林可霉素流动相为0.05 mol/L硼砂溶液(用850 mL/L磷酸调节pH至5.0)-甲醇-乙腈(60∶36∶4),检测波长为214 nm,柱温为室温,流速 1 mL/min,进样量 20 μL[3];大观霉素流动相为乙腈-四氢呋喃-水(30∶35∶35),检测波长为415 nm,柱温为30℃,流速 1 mL/min,进样量 20 μL[16]。

1.2.5 杂质干扰试验 取空白混悬剂(与林可霉素和大观霉素复方混悬剂相比,仅不含林可霉素和大观霉素,其余成分相同)适量,按照“1.2.2”与“1.2.3”的方法处理后,分别对林可霉素和大观霉素进行H LPC检测。

1.2.6 线性关系考察 取盐酸林可霉素储备液,加水稀释得到 10 、15、20、25 、30、35、40 μg/mL 的标准工作液,过0.22 μ m滤膜后进行H LPC检测。另现配大观霉素标准液,加水稀释得到 100、150、200、250、300 、350 、400 μg/mL 的标准工 作液,按“1.2.3 ”处理后终浓度分别为 10、15、20、25、30、35、40 μg/mL,进行HLPC检测。分别将林可霉素和大观霉素色谱峰面积与相应的药物浓度作线性回归。

1.2.7 回收率试验 准确称取大观霉素原料药两组,置于锥形瓶中,一组加入空白辅料,另一组加水溶解。分别稀释得到高、中、低三个添加浓度的混悬剂样品和原料药溶液。混悬剂样品按照“1.2.2”与“1.2.3”方法处理后,分别对林可霉素和大观霉素进行HLPC检测。每个样品重复测定4次,按公式计算不同添加浓度的回收率。回收率=(混悬剂浓度/原料药水溶液浓度)×100%。

1.2.8 精密度试验 准确取林可霉素-大观霉素复方混悬剂样品适量,每批4份,共4批,按照“1.2.2”与“1.2.3”处理后,对林可霉素和大观霉素进行H LPC检测。分别计算林可霉素和大观霉素的批内及批间变异系数。

1.2.9 稳定性试验 取大观霉素同一样品与林可霉素同一样品,分别于 0、3、6、9、12 h 测定 ,以峰面积计算大观霉素和林可霉素(n=5)的RSD。

1.2.10 样品含量测定 根据样品的配制与处理方法,分别检测5批自制林可霉素-大观霉素复方混悬剂中林可霉素和大观霉素的含量。

2 结果

2.1 杂质干扰试验

由图1可知,辅料对盐酸林可霉素和盐酸大观霉素含量的测定均无影响,且盐酸林可霉素与盐酸大观霉素亦相互无影响。

图1 HLPC检测结果Fig.1 The results of HLPC

2.2 线性关系考察

在 10 μg/mL/ ～ 40 μg/mL 范围内,二者的浓度与峰面积均呈良好的线性关系,大观霉素回归方程为:y=1.043 2x+0.817 1,r=0.999 9,n=7;林可霉素回归方程为:y=13.493x-1.987 5,r=1,n=7。

2.3 回收率试验

在浓度10、25、40 μg/mL/时混悬剂中大观霉素回收率分别为99.07%、99.29%和98.94%,平均回收率为99.10%;林可霉素在相应浓度的回收率分别为99.05%、98.61%和 98.54%,平均回收率为98.68%。

2.4 精密度试验

添加浓度均为25 μg/mL,测得的混悬剂中林可霉素与大观霉素的变异系数结果见表1。

2.5 稳定性试验

通过对大观霉素同一样品与林可霉素同一样品 ,在 0、3 、6、9、12 h 测定,以峰面积计算大观霉素和林可霉素(n=5)的RSD分别为0.52%和0.49%。表明供试样品在12 h内稳定。

2.6 样品含量测定

混悬剂中林可霉素平均含量为5%,大观霉素平均含量为10%(表2)。

表1 混悬剂中林可霉素与大观霉素的变异系数Table 1 T he coefficients of variation of lincomycin and spectinomycin in oily suspensions

表2 林可霉素-大观霉素混悬剂的含量Table 2 T he contents of lincomy cin and spectinomycin in oily suspensions

3 讨论

3.1 林可霉素检测方法的选择

文献报道林可霉素HPLC检测波长有204

nm[19]、208 nm[20]、210 nm[4]、214 nm[21],本试验通过对不同浓度的林可霉素标准品溶液在190 nm～400 nm区间进行紫外光谱扫描,结果表明:不同浓度林可霉素标准液的特征吸收峰不同,这与文献[22]报道的林可霉素紫外光谱无特异吸收相同,但与文献[23]报道的211 nm有所不同。美国药典(27版)[4]林可霉素检测色谱条件为:C8柱,以磷酸溶液-甲醇-乙腈(780∶150∶150)为流动相,检测波长210 nm。朱义舟[24]通过对中国药典(2005版)和美国药典(27版)中HPLC法测定盐酸林可霉素含量方法的比较发现,从线性范围、回收率、检测限、定量限以及峰面积等指标来看,中美两国药典尽管色谱条件不同,但测定结果无显著差异。但美国药典要求的条件较苛刻,而中国药典条件较宽松。所以本试验采用中国兽药典(2005版)(中国药典与中国兽药典中林可霉素检测方法相同)林可霉素检测方法检测林可霉素的含量,且取得了较好的检测结果。

3.2 大观霉素检测方法的选择

3.2.1 衍生化 衍生化试剂DNPH与大观霉素的羰基反应生成苯腙化合物DNPH-大观霉素[17],反应需在酸性条件下进行,三氟乙酸(TFA)用于控制反应过程中酸性条件[18]。文献报道 TFA-乙腈溶液的浓度有3%[25]和6%[17],本试验通过对浓度为3%和6%TFA-乙腈溶液进行比较,浓度为6%的 TFA-乙腈溶液作为酸性条件控制溶液所得出大观霉素标准曲线线性较好,所以本试验的大观霉素衍生化反应采用6%TFA作为大观霉素衍生化反应酸性条件的控制溶液。

3.2.2 流动相比例 大观霉素检测中采用的色谱分离方法有梯度洗脱法[18]和等度洗脱法[16],文献[18]报道的梯度洗脱法需采用混合流动相,较为复杂。本试验参考Yan H D等[16]的方法中,大观霉素检测的流动相比例对不同浓度DNPH-大观霉素进行检测,发现大观霉素药物峰与一小的杂质峰分离较差,检测低浓度DNPH-大观霉素时可见该杂质峰,而在检测较高浓度DNPH-大观霉素时,该杂质峰被药物峰所掩盖。通过对流动相中乙腈百分比按30%、35%、40%、45%、50%(流动相中水的百分比作出相应调整)进行试验,结果表明盐酸大观霉素流动相为乙腈-四氢呋喃-水(30∶35∶35)时峰形最佳,且药物峰与杂质峰分离较好。

3.2.3 其他 大观霉素样品的溶剂为乙腈,易挥发,应密封,且应尽快检测完毕。

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Assay of Lincomycin and Spectinomycin in Oily Injectable Suspensions by HPLC

WANG Zhong,WANG Li-qi,LIU Xiao-qin,FAN Hui-min,HUANG Xian-hui,ZENG Zhen-ling

(College of Veterenary Medicine,South China Agricultural University,Guangzhou,Guangdong,510642,China)

A high-performance liquid chromatographic(HPLC)method with ultraviolet-visible detection was developed to measure the concentrations of lincomycin and spectinomycin in their oily injectable suspensions.The separation was performed on a C18 column(4.6 mm ×250 mm,5 μ m),the mobile phase of lincomycin comprised of 0.05 mol/L borax solution(pH5.0,adjusted with 85%phosphoric acid)-methanol-acetonitril(60∶36∶4),UV detection was set at a wavelength of 214nm.the mobile phase of spectinomycin comprised of acetonitril,tetrahydrofuran and water(30∶35∶35),UV detection was set at a wavelength of 415 nm.The standard curves of lincomycin and spectinomycin were linear in the range between 10 μg/mL to 40 μg/mL,rthe average recoveries were 98.68%for lincomycin and 99.10%for spectinomycin,the average intraassay coefficients of variation were 0.93%for lincomycin and 0.86%for spectinomycin,and the interassay coefficients of variability were 1.68%and 0.98%,respectively.The present method was precise and convenient,and could therefore be used to quantify lincomycin and spectinomycin in oily injectable suspensions.

lincomycin and spectinomycin oily injectable suspensions;lincomycin hydrochliride;spectinomycin hydrochliride;HPLC;assay

S859.7

A

1007-5038(2011)09-0058-05

2011-02-28

十一五国家科技支撑计划项目(2006BAD31B06)

王 忠(1985-),男,江西宜春人,硕士研究生,主要从事兽药新制剂的研制。