鹿茸顶端组织IGF1R基因的部分cDNA克隆及差异表达1)

胡 薇 孟星宇 田玉华 刘 宁

(吉林农业大学，长春，130118)

鹿茸角作为一种哺乳动物器官，它具有两个独特的生长特性，即可再生和快速生长。而鹿茸生长发育机制的研究使它成为一个极其重要的哺乳动物骨质器官再生的自然模型［1－2］。鹿茸角生长速度之快是其它哺乳动物组织和器官无法相比的，其生长最旺盛阶段每天可长1～2 cm［3］。因此，人们推测其中可能存在特殊的促进骨和上皮组织快速生长的活性物质，促进骨质和表皮层的增殖。胰岛素样生长因子受体(insulin－like growth factor receptor，IGFR)在动物体的生长发育过程中起着举足轻重的作用。胰岛素样生长因子受体有两种，分别称为IGF1受体和IGF2受体。IGF2受体没有IGF的信号传导功能，可能仅仅是一种清除型受体，其功能在于获取和降解IGF2。IGF对细胞的作用绝大多数都是通过与IGF1受体结合而实现的。而IGF1是一种重要的强有丝分裂原，主要通过IGFR1受体发挥生物学效应，而且两者必须结合才能发挥生物学作用。大量的研究已证明［4］，鹿茸的生长中心位于顶端，该处组织是生长因子和其它很多生理活性成分含量高的部位。冯海华等［5］报道IGF1是一种促细胞分化的生长因子，存在于鹿茸角顶部增殖区，能促进间充质干细胞及软骨细胞的增殖。而Suttie［6］早前曾发现，在鹿茸顶部非骨化部位存在大量受体IGF1R，可促进鹿茸细胞的增殖。近些年的许多研究结果也证明了一些生长因子存在于鹿茸顶部，IGF1和IGF1R可能是影响鹿茸生长速度的主要因素之一。目前，对鹿源IGF1R的研究相对较少，而许多其它动物的IGF1R基因及氨基酸序列在NCBI数据库中都相继被登出。但是，未见有关梅花鹿IGF1R基因方面的相关报道。鉴于IGF1R在动物生长轴上的重要作用，本研究将通过IGF1R基因的部分cDNA克隆及在鹿茸顶端不同部位组织的差异表达分析，揭示鹿茸快速生长阶段IGF1R对其生长的调节作用和规律，为探索鹿茸再生的机理提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜东北梅花鹿鹿茸于2010年6月上旬采自吉林农业大学试验鹿场1头3岁龄左右的健康雄鹿，保存于液氮中立即带回实验室备用。TRIzoL试剂购自Invitrogen公司，pMD－18T vector、Ex Taq DNA聚合酶、AMV反转录酶、限制性内切酶 XbaⅠ和 PstⅠ、dNTP、DL －2000 Marker购自 TaKaRa公司，Real Master Mix购自长春宝泰克公司。

1.2 样品制备

鹿茸组织区别于其他组织和器官的重要一点是生长中心位于顶端，因此，鹿茸的顶端是生长最旺盛的部位。根据组织结构和生长特点，可将鹿茸顶端组织大致分为真皮层、间充质层、前软骨层和软骨层。使用一次性手术刀在离鹿茸顶端生长点5 cm处垂直鹿茸生长轴方向切断，切取真皮层、间充质层、前软骨层和软骨层组织各100 mg，于液氮保存。

1.3 鹿茸顶端组织总RNA提取及RT－PCR反应

按照Trizol操作手册分别提取真皮、间充质、前软骨和软骨组织各样品总RNA，1.0%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光法检测总RNA质量和含量。以总RNA为模板，以Oligo－dT为引物(工作浓度为10 μmol/L)，以逆转录酶AMV反转录合成cDNA。

1.4 IGF1R基因克隆及序列分析

参照GenBank中相关序列，设计IGF1R基因特异性引物(IGF1R上游引物:AAGGAATGAAGTCTG GCTCCG和下游引物:AGGAAGGACAAGGAGACCAAGG)，以软骨组织cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段，并克隆入pMD18－T载体中，转化大肠杆菌JM109，涂板，37℃过夜培养。挑取阳性克隆制备质粒，并将鉴定正确的重组质粒送TaKaRa公司测序。将梅花鹿IGF1R基因与牛(XM_002696504)、猪(NM_214172)、人(BC143721)、小鼠(BC138869)等物种IGF1R基因CDS区DNA及氨基酸序列利用Blast分别进行比对分析。

1.5 Real－time PCR法检测IGF1R基因在鹿茸顶端不同部位组织的表达水平

合成IGF1R基因特异引物(上游引物5'－GCACCATCTTCAAAGGCAATC－3'和下游引物5'－GAGACCAAGGCGTGGGAGT－3')，扩增片段长度为136 bp。以鹿的持家基因actin(GenBank登录号:AY345228)作为内参基因，合成actin引物(上游引物5'－TGACCCTTAAGTACCCCATCGA－3'和下游引物5'－TTGTAGAA GGTGTGGTGCCAGAT－3')，扩增片段长度为85 bp。采用Real Master Mix试剂和7500 Real Time PCR System分析IGF1R基因在真皮层、间充质层、前软骨层和软骨层组织中的转录表达水平。Real－time PCR体系:1 ng总RNA反转录的 cDNA，上下游引物各5 pmol，10 μL real Master Mix，总体积为25 μL。反应条件:94℃激活 DNA聚合酶2 min，94 ℃变性20 s，60 ℃复性30 s，68 ℃延伸45 s;进行40 个循环。随后做PCR产物的扩增曲线分析，使用StepOne Software v2.1软件分析IGF1R相对内参actin基因的差异表达Ct值(Ct为荧光达到荧光阈值的循环数)。

2 结果与分析

2.1 鹿茸顶端组织总RNA的提取

各样品总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳后可清晰见到28 S、18 S和15 S rRNA各1条带(图1)，表明本试验所提取的鹿茸真皮、间充质、前软骨和软骨组织总RNA是基本完整的，材料保存和提取过程未发生RNA降解。

2.2 IGF1R基因的克隆

IGF1R基因PCR扩增产物经电泳得到1 203 bp左右的1条特异性条带(图2)，与预期结果相符。提取质粒，分别用XbaI、PstI双酶切和PCR鉴定重组质粒pMD－18T－ IGF1R(图3)，从图3中可看出，均得到了与目的带大小相符的明显的电泳带，表明克隆基本成功。

2.3 IGF1R基因的序列分析

东北梅花鹿IGF1R基因与其它4个物种的DNA和氨基酸序列比对结果分别见图4和图5。其中:梅花鹿IGF1R基因编码区部分序列为1203 bp，与牛、猪、人和小鼠核酸序列同源性分别为 98.07%、94.21%、93.94%、88.05%(图 4);IGF1R蛋白氨基酸序列长度为401个氨基酸，与牛、猪、人和小鼠同源性分别为 98.3%、98.5%、97.8%和 94.5%(图 5)。

图1 鹿茸顶端组织总RNA提取结果

图2 IGF1R基因的PCR扩增结果

图3 重组质粒pMD－18T－IGF1R的PCR和双酶切鉴定结果

2.4 IGF1R基因在鹿茸顶端不同部位组织的差异表达

相对荧光定量PCR结果显示:以梅花鹿actin作为内源参照基因，在鹿茸顶端间充质、真皮、前软骨和软骨组织中，IGF1R基因mRNA转录水平存在着明显的差异。其中:在软骨区转录表达水平高于其它部位;其次，由高到低为前软骨层、真皮层和间充质层。见图6、表1。

图4 东北梅花鹿、牛、猪、人及小鼠IGF1R基因DNA序列分析

图5 东北梅花鹿、牛、猪、人及小鼠IGF1R氨基酸序列分析

图6 鹿茸顶端不同部位组织IGF1R基因的PCR扩增曲线横坐标为Cycle;纵坐标为ΔRn。

表1 相对荧光定量PCR法检测鹿茸顶端组织IGF1R基因的表达水平(n=3)

3 讨论

近年来，国内外学者相继在鹿茸中发现了各种细胞生长因子，如胰岛素样生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、转化生长因子，表明鹿茸是一个天然的细胞生长因子库［7－8］。最近研究表明，鹿茸生长因子不但与鹿茸生长有关，还与鹿角柄的形成及鹿茸的转化有关［9］。已知IGF1R为糖蛋白，是一种细胞生长因子受体，广泛表达于多种细胞的表面，它接受IGF1和IGF2的刺激发挥促细胞生长、分裂及分化等生理作用［10］，介导IGF1和大部分IGF2的生物活性，维持细胞的最佳生长条件和促进细胞的转化。Elliott［11］曾报道鹿茸顶端存在IGF－1受体，并推测IGF－1R在鹿茸顶部以内分泌的方式发挥其作用。而IGF－1是一类多功能细胞增殖调控因子，通过与IGF1R受体结合而发挥作用，对胚胎发育和多种细胞的生长增殖都在不同程度上发挥了积极的生物学功能［12］。因此，IGF1R基因对动物体的生长发育具有重要的作用。

目前，鹿的IGF1R基因研究甚少，且cDNA尚未得到克隆，GenBank中关于梅花鹿IGF1R基因序列没有任何记录。本研究根据牛和猪的IGF1R基因序列设计引物，通过RTPCR和PCR技术克隆了梅花鹿IGF1R基因cDNA的部分序列，并与牛、猪、人和鼠4个物种IGF1R基因进行了核苷酸和氨基酸序列的比较分析，结果表明:该序列与牛、猪的IGF1R基因序列高度同源。

RT－PCR是一种非常敏感的检测方法，但无论竞争RT－PCR还是内源性参比基因RT－PCR定量法，它们均属PCR终点检测法，在PCR扩增的指数期和平台期产量相差极大，很难对起始模板数准确定量。荧光定量PCR技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、灵敏度高、重复性好和定量准确等优点，成为基因工程研究中的重要工具，目前已得到广泛应用［13］。本研究利用Real time PCR方法，以梅花鹿actin基因作为内源参照基因，对梅花鹿IGF1R基因的4种组织进行了组织相对定量表达分析，结果表明:IGF1R基因在检测的所有组织中均有不同程度的表达，该结果具有很好的重复性和稳定性，且检测结果用拷贝数来表示起始模板的含量，相对半定量RT－PCR中的比较值更为准确可靠。通过数据分析显示:IGF1R基因在软骨组织中表达量最高;其次，由高到低依次为前软骨层、真皮层和间充质层。试验结果初步表明，IGF1R是鹿茸再生过程中软骨生长的主要调节因子之一。

目前，国内外对IGF1R基因的研究主要集中在其与肿瘤的关系上［14－15］，提示IGF1R和IGF1以自分泌途径参与肿瘤发病过程，由于两者活性增强，促使受体活化水平的提高和信号转导增强，进而促进细胞的异常增殖;而鹿茸细胞的增殖速度比肿瘤细胞快30倍。IGF1R基因到底在鹿茸组织中发挥着怎样的功能，还需要今后大量的试验研究去证实。近几年，笔者在寻找参与鹿茸再生调控的关键因子方面取得了一定的进展，但是对于鹿茸复杂的生长调控机制研究而言，仍然处于初级阶段。本研究只是针对IGF1R基因在东北梅花鹿这个物种上进行了初步的探索，为进一步研究IGF1R在鹿茸角快速生长和再生过程中可能具有的重要作用，提供一定参考和可利用的基础试验数据。

［1］Kierdorf U，Kierdorf H，Szuwart T.Deer antler regeneration:cells，concepts，and controversies［J］.J Morphol，2007，268(8):726 －738.

［2］Price J，Faucheux C，Allen S.Deer antlers as a model of mammalian regeneration［J］.Curr Top Dev Biol，2005，67:1 － 48.

［3］郝丽，李和平，严厉.东北梅花鹿鹿茸尖端组织全长cDNA文库的构建［J］.东北林业大学学报，2009，37(11):120 －122.

［4］Li Chunyi，Suttie J M.Tissue collection methods for antler research［J］.European Journal of Morphology，2003，41(1):23 －30.

［5］冯海华，闭兴明，赵丽红，等.胰岛素样生长因子1对不同生长时期鹿茸生长中心细胞体外增殖的影响［J］.中国组织工程研究与临床康复，2007，11(37):7373 －7376.

［6］Suttie J M，White R G，Breier B H，et al.Photoperiod associated changes in insulin-like growth factor-I in reindeer［J］.Endocrinology，1991，129(2):679 －682.

［7］刘学东，张子栋，郑冬，等.东北马鹿鹿茸软骨组织cDNA文库构建及IGF2基因克隆与结构分析［J］.中国农业科学，2008，41(9):2806－2812.

［8］王秋玉，王本祥.论鹿茸生长因子［J］.中医药学报，2000，28(6):10－12.

［9］Li Chunyi，Littlejohn R P，Suttie J M.Effects of insulin-like growth factor I and testosterone on the proliferation of antlerogenic cells in vitro［J］.J Exp Zool，1999，284(1):82 －90.

［10］Navarro M，Baserga R.Limited redundancy of survival signals from the type 1 insulin-like growth factor receptor［J］.Endoerinology，2001，142(3):1073 －1081.

［11］Elloitt J L，Oldham J M，Asher G W，et al.Effect of testosterone on binding of insulin-like growth factor-Ⅰ (IGF-Ⅰ)and IGF-Ⅱin growing antlers of fallow deer(Dama dama)［J］.Growth Regul，1996，6(4):214 －221.

［12］赵红霞，詹勇，许梓荣，等.胰岛素样生长因子－1研究与应用［J］.畜牧与兽医，2002，34(6):36 －38.

［13］赵焕英，包金风.实时荧光定量PCR技术的原理及其应用研究进展［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2007，16(4):492－497.

［14］谢庆祥，林吓聪，张闽峰，等.IGF1和IGFR在膀胱癌组织中表达的意义［J］.癌症，2004，23(6):707 －709.

［15］丁娟娟.胰岛素样生长因子一及其受体在胃癌中的表达和意义［D］.天津:天津医科大学，2006.