八肽胆囊收缩素通过p38 MAPK通路抑制LPS诱导的RAW264.7细胞IL-1β表达

倪志宇，丛 斌，董 玫，马春玲，李淑瑾，付丽红，张晓静，文 迪，徐之璐

(河北医科大学基础医学院法医学系，河北省法医学重点实验室，河北石家庄 050017)

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase，MAPK)是介导细胞反应的重要信号系统，参与细胞增殖、分化和凋亡等生理及病理过程，p38 MAPK是控制炎症反应最主要的MAPK家族成员之一［1］。在许多重症疾病如脓毒症、ARDS、严重烧伤、急性胰腺炎中均可检测到p38 MAPK的激活，大量研究表明阻断p38级联能减轻炎症反应［2］。

八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide，CCK-8)属小分子肽类物质，参与调节中枢神经、内分泌、免疫等多系统机能活动。研究表明，CCK-8具有抗内毒素休克(endotoxin shock，ES)作用。在ES大鼠肺组织及大鼠肺间质巨噬细胞(pulmonary interstitial macrophages，PIMs)，CCK-8 可通过激活cAMP-PKA 信号通路［3］，抑制 PKC 通路［4－5］而抑制NF-κB 的活性［6］，从而抑制炎症介质的表达［7］，发挥抗ES作用。但CCK-8是否通过p38 MAPK通路调控炎症反应尚未见报道。本研究将观察CCK-8对LPS诱导RAW264.7细胞 IL-1β表达的影响及p38 MAPK在CCK-8调控LPS诱导IL-1β表达中的作用，以进一步阐明CCK-8的抗炎作用机制。

1 材料与方法

1.1材料RAW264.7细胞(同济医科大学)、大肠杆菌脂多糖(LPS E.Coli 0111:B4)、八肽胆囊收缩素、p38 MAPK特异性抑制剂SB203580(美国Sigma公司);小鼠单克隆磷酸化p38抗体(美国Santa Cruz公司);HRP-羊抗小鼠IgG(北京中山公司);小鼠IL-1β ELISA Kit(法国Diaclone公司);TRIzol(美国Invitrogen公司);AMV逆转录酶(美国Promega公司);Taq DNA聚合酶(上海Sangon公司)。

1.2细胞培养及分组RAW264.7细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，细胞生长至对数生长期时，调整细胞浓度为每瓶1×107细胞，加入无血清RPMI 1640培养基及不同处理因素，孵育细胞。分组:① LPS诱导RAW264.7细胞IL-1β表达高峰的时间点:细胞培养基中加入LPS(1 mg·L－1)，分别孵育不同时间(0、3、6、12、24 h);②不同浓度CCK-8对LPS诱导RAW264.7细胞IL-1β表达及p38 MAPK活化的影响:对照组:细胞培养基中加入与实验组等体积的生理盐水;LPS组:细胞培养基中加入LPS(1 mg·L－1);LPS+CCK-8组:细胞培养基中先加入 CCK-8(10－10、10－8、10－6mol·L－1)，孵育10 min 后加入 LPS(1 mg·L－1);LPS+SB203580组:细胞培养基中加入 SB203580(10 μmol·L－1)，孵育30 min 后加入 LPS(1 mg·L－1);LPS+SB203580+CCK-8组:细胞培养基中加入SB203580(10 μmol·L－1)，孵育 30 min 后加入CCK-8(10－8mol·L－1)，孵育 10 min 后加入 LPS(1 mg·L－1);CCK-8组:细胞培养基中加入 CCK-8(10－8mol·L－1);SB203580 组:细胞培养基中加入SB203580(10 μmol·L－1);CCK-8+SB 组:细胞培养基中加入 SB203580(10 μmol·L－1)，孵育 30 min后加入CCK-8(10－8mol·L－1)。以上各组分别孵育不同时间后检测细胞IL-1β(6 h)、IL-1β mRNA(3 h)、p38 MAPK(30 min)的表达。

1.3ELISA法检测IL-1β的表达使用ELISA试剂盒分析细胞培养上清中IL-1β浓度。

1.4RT-PCR法检测IL-1βmRNA表达利用TRIzol提取细胞总RNA。取4.0 μg总RNA，65℃变性5 min，经AMV逆转录酶42℃逆转录30 min，合成cDNA。取5 μl cDNA产物，依次加入10×PCR缓冲液，上、下游引物 50 pmol，dNTP 0.2 mmol·L－1，MgCl22.0 mmol·L－1，Taq DNA polymerase 1 U，以下列条件进行扩增:94℃ 3 min;94℃ 45 s;52℃ 45 s(IL-1β)，55℃ 45 s(β-actin);72℃ 45 s。进行30次循环后进一步延伸72℃ 5 min。扩增产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳。引物由上海生工公司合成。序列如下:IL-1β(上游5'-GCTTCAGGCAGGCAGTAT-3'，下 游 5'-ACAAACCGCTTTTCCATCT-3'，扩增产物475 bp)，β-actin(上游5'-CTGTCCCTGTATGCCTCT-3'，下游 5'-ATGTCACGCACGATTTCC-3'，扩增产物218 bp)。用Gel-pro凝胶分析软件对电泳谱带进行半定量分析，用任意单位(AU)表示凝胶谱带的面积×荧光强度值，各细胞因子与β-actin的AU比值代表各mRNA相对表达水平。

1.5Western blot法检测p-p38 MAPK表达将各组细胞提取蛋白质并进行定量后，电印迹转移法将凝胶内的蛋白转至硝酸纤维素膜。加入p-p38小鼠单克隆抗体(稀释度1∶80)，4℃孵育过夜，TBS洗膜3次，加入 HRP标记的二抗(稀释度1∶1 000)，37℃孵育1 h，TBS洗膜后，化学发光法显色。使用成像分析系统对显色条带进行光密度分析。

1.6统计学分析用SPSS统计分析软件进行统计学分析。数据用±s表示，各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA)，用最小显著差法(least significant difference，LSD)作两两比较。

2 结果

2.1LPS诱导RAW264.7细胞IL-1β表达高峰的时间点RAW264.7细胞mRNA水平及细胞培养上清中IL-1β含量随LPS刺激时间的延长而升高，分别于LPS刺激后3 h及6 h达到高峰，与其他时间点相比差异均有显著性(P＜0.01，P＜0.05)，见Tab 1，Fig 1。

Tab 1 The production of IL-1β in RAW264.7 cells induced by LPS for different time(±s，n=3)

Tab 1 The production of IL-1β in RAW264.7 cells induced by LPS for different time(±s，n=3)

△△P＜0.01 vs LPS 0 h;＊＊P ＜0.01 vs LPS 6 h;▲P ＜0.05 ，▲▲P＜0.01 vs LPS 3 h

Group IL-1β(ng·L－1)IL-1β mRNA(IL-1β/β-actin ratio)LPS 0 h 0.00 ±0.00 0.000 ±0.000 3 h 34.11 ±4.83△△＊＊ 0.723 ±0.030△△6 h 209.41 ±10.04△△ 0.665 ±0.015△△▲12 h 106.48 ±8.36△△＊＊ 0.366 ±0.035△△▲▲24 h 74.32 ±7.37△△＊＊ 0.211 ±0.020△△▲▲

Fig 1 The expression of LPS-induced IL-1β mRNA in RAW264.7 cells for different time

2.2不同剂量CCK-8对LPS诱导RAW264.7细胞IL-1β表达的影响1 mg·L－1LPS孵育RAW264.7细胞6 h(3 h)，细胞上清中IL-1β含量(细胞IL-1β mRNA水平)明显高于对照组(P＜0.01)。10－10mol·L－1CCK-8 对 LPS诱导的 IL-1β生成无影响，10－8、10－6mol·L－1CCK-8 可明显抑制LPS诱导的IL-1β生成，和LPS组相比抑制率分别为 50.7%、82.2%(IL-1β含量)及 50.5%、72.5%(IL-1β mRNA)(P＜0.01)，见 Tab 2，Fig 2。

Fig 2 Effects of CCK-8 on LPS-induced IL-1βmRNA expression in RAW264.7 cells

Tab 2 Effects of CCK-8 on LPS-induced IL-1β production and p-p38 MAPK expression in RAW264.7 cells(±s，n=3)

Tab 2 Effects of CCK-8 on LPS-induced IL-1β production and p-p38 MAPK expression in RAW264.7 cells(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs control;▲P＞0.05，▲▲P＜0.01 vs LPS

Group IL-1β(ng·L －1)IL-1β mRNA(IL-1β/β-actin ratio)p-p38 MAPK(p-p38 MAPK/β-actin ratio)Control 0.00 ±0.00 0.000 ±0.000 0.114 ±0.021 LPS 209.41 ±10.04＊＊ 0.728 ±0.044＊＊ 1.177 ±0.090＊＊LPS+CCK-8 10－10mol·L－1 202.98 ±9.65＊＊▲ 0.718 ±0.044＊＊▲ 1.194 ±0.061＊＊▲LPS+CCK-8 10－8mol·L－1 103.26±12.14＊＊▲▲ 0.360±0.040＊＊▲▲ 0.633 ±0.606＊＊▲▲LPS+CCK-8 10－6mol·L－1 37.32±7.37＊＊▲▲ 0.200±0.013＊＊▲▲ 0.320 ±0.026＊＊▲▲CCK-8 10 －8mol·L －10.00 ±0.00 0.000 ±0.000 0.083 ±0.017

2.3不同剂量CCK-8对LPS诱导RAW264.7细胞p38 MAPK活性的影响对照组及CCK-8组RAW264.7细胞p-p38 MAPK水平较低，LPS刺激30 min可使细胞 p-p38 MAPK水平明显升高，较对照组相比增加了约9.32倍(P＜0.01)。10－10mol·L－1CCK-8对LPS诱导的 p-p38 MAPK水平无明显影响，10－8、10－6mol·L－1CCK-8 剂量依赖性地抑制LPS诱导的p-p38 MAPK水平，抑制率分别为44.1%和71.9%(P＜0.01)，但 p-p38 MAPK水平仍高于对照组(P＜0.01)，见Tab 2，Fig 3。

Fig 3 Effects of CCK-8 on p-p38 MAPK expression in LPS-induced RAW264.7 cells

2.4p38 MAPK在CCK-8调控LPS诱导RAW264.7细胞IL-1β表达中的作用对照组、CCK-8组、SB组及CCK-8+SB组均未检测到IL-1β及其mRNA的表达。1 mg·L－1LPS诱导了IL-1β及其 mRNA 的表达(P＜0.01)。10－8mol·L－1CCK-8抑制了LPS诱导的IL-1β及其mRNA表达，抑制率为分别为50.6%和47.7%(P＜0.01)。10 μmol·L－1SB203580抑制了 IL-1β 及其 mRNA表达，抑制率分别为57.3%及56.7%(P＜0.01)。10 μmol·L－1SB203580 与 10－8mol·L－1CCK-8 共同作用进一步抑制了LPS诱导的IL-1β及其mRNA表达，抑制率分别77.6%和78.4%(P＜0.01vsLPS组、LPS+SB 组、LPS+CCK-8 组)，见 Tab 3，Fig 4。

3 讨论

在参与炎症反应的众多介质中，最有影响的是TNF-α、IL-1β等，与内毒素休克发病和死亡的关系也最为密切［7－8］。本研究发现，LPS刺激可迅速诱导RAW264.7细胞IL-1β及其mRNA的表达，而预先给予CCK-8可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞IL-1β及其mRNA的表达。说明CCK-8通过抑制促炎性细胞因子的表达参与机体抗炎反应过程，且CCK-8对细胞因子生成的调控作用发生在转录水平。这与本室报道CCK-8可抑制LPS诱导的大鼠PIMs TNF-α［6］、IL-1β［7］表达的结果一致。

Tab 3 Effects of CCK-8 and SB203580 co-incubation on IL-1β production in LPS-induced RAW264.7 cells(±s，n=3)

Tab 3 Effects of CCK-8 and SB203580 co-incubation on IL-1β production in LPS-induced RAW264.7 cells(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs control;▲▲P＜0.01 vs LPS;△△P＜0.01 vs LPS+CCK-8 and LPS+SB

0.00 ±0.00 0.000 ±0.000

Fig 4 Effects of CCK-8 and SB203580 co-incubation on IL-1β mRNA expression in LPS-induced RAW264.7 cells

MAPK是介导细胞外信号引起细胞核反应的极其重要的信号系统，已证明在哺乳动物中存在4个MAPK成员，即 ERK、JNK/SAPK、p38和 ERK5/BMK1等MAPK亚族，其中p38 MAPK通路主要对炎性细胞因子和多种类型的细胞应激信号进行转导，大量研究表明阻断 p38级联能减轻炎症反应［1－2］。本研究发现，LPS 迅速诱导 RAW264.7 细胞p38 MAPK的激活，而CCK-8则浓度依赖性地抑制LPS诱导的p38 MAPK的活化，说明CCK-8发挥抗炎作用是通过抑制p38 MAPK的活化完成的。

为进一步明确p38 MAPK在CCK-8调控LPS诱导的RAW264.7细胞IL-1β表达中的作用，我们又观察了p38 MAPK特异性抑制剂 SB203580和CCK-8共同作用对LPS诱导的RAW264.7细胞 IL-1β 表达的影响。研究发现，10 μmol·L－1SB203580抑制了LPS诱导的p38 MAPK的活化，抑制率为87.2%，接近至未刺激水平;但10 μmol·L－1SB203580仅抑制了约57.3%IL-1β及56.7%IL-1β mRNA表达，说明还有p38 MAPK之外的其他通路调控IL-1β的表达，这与多数学者证实的多条通路调控IL-1β表达的研究结果一致。而加入CCK-8后进一步抑制了 LPS诱导的IL-1β及其IL-1β mRNA的表达(分别抑制了约77.6%及78.4%)，说明CCK-8通过抑制p38 MAPK的激活以及p38 MAPK以外的其他通路抑制IL-1β的表达，参与炎症反应。我室多项研究证实，CCK-8可抑制 ES大鼠 PIMs CD14［9］及TLR4［10］的表达、抑制 PKC 活性［5］及 NF-κB［6］、AP-1(数据未发表)的DNA结合活性，从而抑制TNF-α和IL-1β的表达而发挥抗ES作用。已知在LPS诱导的炎症反应中，LPS与其受体CD14、TLR4结合，将LPS信号由细胞外传导至细胞内，通过一系列信号通路使NF-κB、AP-1等转录因子激活，诱导炎症介质的表达［11］。而CCK-8则可通过抑制信号通路中 CD14、TLR4、PKC、p38 MAPK、NF-κB、AP-1 等多层次、多靶点调控TNF-α、IL-1β等炎性介质的表达，从而发挥抗炎作用。提示我们在一些急慢性炎症相关性疾病的治疗中，CCK-8可能是一种潜在有效的治疗因子。

以往有关CCK-8与p38 MAPK的研究多针对急性胰腺炎，并证实，CCK-8通过激活p38 MAPK参与急性胰腺炎的发病过程。但CCK的信号转导机制具有细胞及组织特异性。Meng等［12］发现，CCK-8可激活ES大鼠肺组织及脾组织p38 MAPK并抑制了肺组织TNF-α水平。本室已证实，CCK-8可抑制TNF-α诱导的滑膜细胞株RSC-364 p38 MAPK活性［13］。因此，CCK-8在不同组织和细胞对 p38 MAPK的调控尚需进一步研究。

［1］Keshet Y，Seger R.The MAP kinase signaling cascades:a system of hundreds of components regulates a diverse array of physiological functions［J］.Methods Mol Biol，2010，V661N:3 －38.

［2］Chen S R，Xu X Z，Wang Y H，et al.Icariin Derivative inhibits inflammation through suppression of p38 mitogen-activated protein kinase and nuclear factor-κB pathways［J］.Biol Phar Bull，2010，33(8):1307－13.

［3］高维娟，许顺江，丛 斌，等.CCK-8对大鼠肺间质巨噬细胞cAMP-PKA信号通路的激活作用［J］.中国药理学通报，2007，23(3):321 －6.

［3］Gao W J，Xu S J，Cong B，et al.Activation of cAMP-PKA signal pathway by CCK-8 in rat pulmonary interstitial macrophages［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(3):321 －6.

［4］高维娟，许顺江，丛 斌，等.CCK-8抗炎作用中DAG-PKC信号通路对cAMP-PKA信号通路的影响［J］.中国药理学通报，2008，24(9):1156－9.

［4］Gao W J，Xu S J，Cong B，et al.Effects of DAG-PKC signaling pathway on cAMP-PKA signaling pathway in anti-inflammatory effects of CCK-8［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(9):1156 －9.

［5］Xu S J，Gao W J，Cong B，et al.Effect of cholecystokinin octapeptide on diacylglycerol-PKC signaling pathway in rat pulmonary interstitial macrophages stimulated by lipopolysaccharide［J］.Acta Pharmacol Sin，2005，26(12):1497 －504.

［6］李淑瑾，姚玉霞，朱桂军，等.八肽胆囊收缩素抑制脂多糖诱导的大鼠肺间质巨噬细胞TNF-α及NF-κB活性［J］.中国病理生理杂志，2004，20(8):635－8.

［6］Li S J，Yao Y X，Zhu G J，et al.Cholecystokinin octapeptide inhibits tumor necrosis factor-α transcription and nuclear factor-κB activity induced by lipopolysaccharide in rat pulmonary interstitial macrophages［J］.Chin J Pathophys，2004，20(8):635 －8.

［7］倪志宇，丛 斌，李淑瑾，等.CCK-8对LPS攻击小鼠IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10表达的影响［J］.中国病理生理杂志，2007，23(2):331－5.

［7］Ni Z Y，Cong B，Li S J，et al.Effects of cholecystokinin octapeptide on expression of IL-1β，IL-6，IL-4 and IL-10 in LPS-attacked mice［J］.Chin J Pathophys，2007，23(2):331 － 5.

［8］Tang X R，Woodward T，Amar S.A PTP4A3 peptide PIMAP39 modulates TNF-alpha levels and endotoxic shock［J］.J Innate Immun，2009，2(1):43－55.

［9］Li S J，Cong B，Yan Y L，et al.Cholecystokinin octapeptide inhibits thein vitroexpression of CD14 in rat pulmonary interstitial macrophages induced by lipopolysaccharide［J］.Chin Med J，2002，115(2):276－9.

［10］倪志宇，李淑瑾，丛 斌，等.CCK-8抑制LPS诱导的大鼠肺间质巨噬细胞TLR4及IL-1β的表达［J］.基础医学与临床，2005，25(2):137－40.

［10］Ni Z Y，Li S J，Cong B，et al.Inhibitory effect of CCK-8 on the expressions of TLR4 and IL-1β in LPS-induced pulmonary interstitial macrophages of rats［J］.Basic Clin Med，2005，25(2):137 －40.

［11］Mogensen T H.Pathogen recognition and inflammatory signaling in innate immune defenses［J］.Clin Microbiol Rev，2009，22(2):240－73.

［12］Meng A H，Ling Y L，Zhang X P，et al.CCK-8 inhibits expression of TNF-α in the spleen of endotoxic shock rats and sigual transduction mechanism of p38 MAPK［J］.World J Gastroenterol，2002，8(1):139－43.

［13］韩冬艳，丛 斌，徐锦荣，等.CCK-8对IL-1β诱导大鼠滑膜细胞株RSC-364增殖的影响［J］.中国药理学通报，2006，22(9):1075－8.

［13］Han D Y，Cong B，Xu J R，et al.Effect of CCK-8 on IL-1β-induced RSC-364 proliferation［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(9):1075－8