PERV基因对姜曲海猪产仔数的影响

陶 勇，周 俊，任善茂，张绍祥，董晓君，高勤学

(1.江苏畜牧兽医职业技术学院，江苏 泰州 225300;2.仪征市新集镇兽医站，江苏 仪征 210095;3.淮安市楚州区兽医站，江苏 淮安 223200)

猪内源性反转录病毒 (Porcine endogenous retrovirus，PERV)是指以前病毒DNA形式整合进宿主细胞基因组中，并随细胞染色体复制而复制的反转录病毒，其在体外感染人源细胞的发现引起了人们对异种移植安全性的广泛关注［1-2］。实际上，这些内源性反转录病毒经常包含有突变成分，有提供抵制感染的保护作用，并且涉及到繁殖 过 程。2007 年， TAMU (TEXAS A＆M University)一个研究小组发现绵羊en JSRVs对早期妊娠和受精卵着床具有重要作用，采用RNA干扰的方法，阻止en JSRVs基因的表达，会引起妊娠的终止［3］。我们以姜曲海猪为研究对象，检测分析PERV囊膜基因env 3种通用基因型在姜曲海猪中存在情况，并进一步分析不同基因型与姜曲海猪产仔数的关系，以期对姜曲海猪的开发利用提供一定的参考。

1 材料和方法

1.1 试验猪

随机选取有哺乳记录的纯种姜曲海猪60头，采集耳组织样，并收集每头母猪的产仔记录。

1.2 工具酶和试剂

Taq DNA聚合酶、蛋白酶K等购自Promega公司，DNA Marker DL2000购自大连宝生物公司(TaKaRa)。

1.3 耳组织DNA制备

耳组织采用USSTE裂解液与蛋白酶K消化，再用酚-氯仿抽提的方法制备DNA，DNA样品溶于TE中，储存于-20℃备用。

1.4 引物的设计与合成

根据目前通用的 PERV-env基因分型方法［4］，合成了3对用于分型检测的引物 env-A、env-B、env-C。 序 列:env-AF:5'-TGGAAAGATTGGCAA CAGCG-3';env-AR:5'-AGTGAATGTTAGGCTCAG TGG-3';env-BF:5'-TTCTCCTTTGTCAATTCCGG-3';env-BR:5'-TACTTTATCGGGTCCCACTG-3';env-CF:5'-CTGACCTGGATTAGAACTGG-3';env-CR:5'-ATGTTAGAGGATGGTCCTGG-3'。

1.5 PCR扩增

PCR反应在10μL体系中进行，在无菌指形管中依次加入 1μL 耳组织 DNA、10×buffer 1μL、25mmol·L-1MgCl21μL、dNTPs 混合物 (2.5mmol each)0.8μL、上下游引物 (50 pmol)各 0.4μL、Taq DNA聚合酶 (50 U·μL-1)0.1μL，加无菌去离子水至10μL。94℃预变性4min，94℃变性30 s，55℃复性45 s，72℃延伸45 s，30个循环，最后72℃延伸5min;4℃保温。

1.6 琼脂糖凝胶电泳

用1×TBE电泳缓冲液制备2%琼脂糖凝胶，加 EB 至终浓度 0.5μg·mL-1，取 3μL PCR 扩增产物，加溴酚兰混匀。以5 V·cm-1的电压进行电泳，用紫外透射仪分析扩增结果。

2 结果和分析

2.1 PCR的检测结果

由图1可见，PCR扩增产物特异性良好，片段长度与所设计的片段大小一致。

各基因型频率ABC为0.90(54个体数)，AB为0.03(2个体数)，AC为0.03(3个体数)，O(PERV-env 3种亚型均未检测到)为0.03(1个体数)。绝大部分姜曲海猪个体内均有 PERV-A、B、C型的存在，但有1个样品未检测到PERV-B型，1个样品未检测到PERV-C型，1个样品3种亚型均未检测到。

图1 PERV-env 3种亚型PCR的检测结果

2.2 不同基因型间产仔数的关系

由表1可知，在所统计的姜曲海猪胎次内，AB、AC、O 3种基因型的产仔数高于ABC型的产仔数。PERV的存在可能有降低猪产仔数的趋势。

表1 PERV-env基因型间的产仔数

3 小结和讨论

检测结果显示，在姜曲海猪所有被检样品中，绝大部分个体均存在PERV-env的3种类型，这与有关文献报一致［5-6］。但潘汉世［7］在广西巴马小型香猪群体中却没有发现C亚型，这可能与广西巴马小型香猪是由于长期近亲交配形成的封闭群体有关。

PERV对猪繁殖性能的影响至今尚未见相关报道。但中国农业大学［8］的研究表明，繁殖力高的猪品种如梅山猪其PERV拷贝数普遍高于其他品种，这是否意味着PERV在猪繁殖过程中起着重要的作用。本试验分析了PERV-env基因型对产仔数的影响，结果表明，PERV-env 3种亚型中，缺失型个体的产仔数高于3种亚型全检出的个体。由于条件限制，本试验中所检测的姜曲海猪个体数还较少，可靠性较低，今后可以在此研究基础上扩大检测群体或其他地方品种猪上来验证这个结果。

［1］Patience C，Takeuchi Y，Weiss R A.Infection of human cells by an endogenous retrovirus of pigs［J］.Nat Med，1997，3(3):282-286.

［2］Joachim Denner.Recombinant porcine endogenous retroviruses(PERV-A/C):a new risk for xenotransplantation ［J］.Arch Virol，2008，153:1421-1426.

［3］Jonsson S R.，LaRue R S.The restriction of zoonotic PERV transmission by human ［J］.APOBEC3G PLoS ONE，2007，2(9):893.

［4］Sarah K P，David A M，Peter J M，et al.Transient transmission of porcine endogenous retrovirus to fetal lambs after pig islet tissue xenotransplantation ［J］.Immunology and Cell Biology，2007，85:238-248.

［5］徐斯日古楞，吕茂民，吴健敏，等.中国巴马小型猪中猪内源性反转录病毒的检测 ［J］.动物医学进展，2003，24(6):79-81.

［6］Bosch S，Arnauld C，Jestin A.Study of full length porcine endogenous retrovirus genomes with envelope gene polymorphism in a specific-pathogen-free large white swine herd ［J］.Jviol，2000，74(18):8575.

［7］潘汉世.广西巴马小型猪内源性反转录病毒的检测及分子生物学特性的研究 ［D］.南宁:广西大学，2007.

［8］Li Z，Ping Y.Phylogenetic analysis of porcine endogenous retrovirusesexpressed in Chinese pigs based on envelope sequences ［J］.Transplant Proc，2006，38(7):2252-2257.