AFLP技术在番茄品种鉴定中的应用

刘淑君，杨悦俭，叶青静，王荣青

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004;2.浙江省农业科学研究院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

传统的番茄品种鉴定有形态学［1］、细胞学［2］及同工酶法［3］等，但其结果易受环境条件影响，或因多态性低，使应用范围受到限制，对于基因型的准确鉴定更为困难。DNA分子标记为蔬菜品种鉴定开辟了崭新的研究和应用领域，它有助于直接从分子水平上了解蔬菜品种间的差异，使育种过程更直观，目的性更强，对于选择合适的杂交组合以保持或获得更好的重组优良品种显得极为有效与准确。其中，AFLP (amplified fragment length polymor-phism)是在RAPD和RFLP标记系统基础上发展而来的一种分子标记技术［4］，具有可同时对多位点进行检测、重复性好、信息量大、符合孟德尔遗传的特点，非常适合品种多样性检测和品种鉴定。本研究利用 AFLP技术对12个番茄品种材料进行DNA多态性分析，并以筛选的6对引物的扩增结果为依据，建立番茄品种鉴定方法，以期为生产上番茄品种的判断提供新的科学方法。现将有关结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的番茄品种 (育种材料)共 20个:9179、198、07-020、07-021、07-025、07-026、07-027、07-029、9818、浙粉 208、浙粉 202、浙杂203、浙杂 210、浙杂 2218、浙杂 2102、浙杂6299、浙杂 2346、浙杂 1802、浙杂 205、以色列189(表 1)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

所有番茄材料播于15孔的育苗穴盘中，育苗基质采用草炭、蛭石体积比2∶1，待番茄幼苗长出2片子叶时，提取子叶DNA进行分析。

DNA提取参照姚金晓等［5］的CTAB小量提取方法，并进行改良。1.5 mL离心管加入新鲜叶片0.01 g;加入250 μL CTAB缓冲液 (100 mL 1 mol·L-1TRIS pH 7.5，140 mL 5 mol·L-1NaCl，20 mL 0.5 mol·L-1EDTA pH 8.0，740 mL MiliQ H2O，20 g CTAB)，用尖头玻棒轻轻研磨，然后再加入250 μL CTAB混匀;65℃水浴1 h;置于4℃冰箱或室温冷却至15℃以下;加入250 μL 24∶1氯仿/异戊醇，上下混匀5 min，保证样品与氯仿充分混和;12 000 r·min-1离心10 min;取上清液 200 μL，加入预先加好200 μL异丙醇的1.5 mL离心管中，轻轻上下颠倒混匀;4℃冰箱静置30 min以上;10 000～12 000 r·min-1离心10 min，弃上清液;吹干DNA，让异丙醇挥发干净;加入 100 μL ddH2O(含1 μL 10 mg·mL-1的RNase)溶解DNA;37℃水浴或室温1 h去除RNA;然后用1%的琼脂糖电泳检测。提取的DNA贮备在-20℃的冰箱中备用。

1.2.2 AFLP分析

参照Vos等［6-7］方法，并进行了改良。

1.2.3 模板DNA酶切及连接

表1 供试20份番茄育种材料 (或品种)的名称、来源及主要特性

每个反应总体积为 25 μL，其中包括:DNA 250 ng，Eco R I 1.25 U(10 U·μL-1)和Mse I 2.5 U(10 U·μL-1)，Eco R I adaptor 0.5 μL(5 pmol·μL-1)，Mse I adaptor 0.5 μL(5 pmol·μL-1)，ATP 0.5 μL(10 mmol·L-1)，10 ×buffer(with BSA)5 μL，T4 DNA Ligase 1 U(5 U·μL-1)，ddH2O 15.425 μL，混匀后37℃水浴3 h以上。

1.2.4 DNA片段预扩增

取2.5 μL连接酶切后 DNA模板，加入22.5 μL的预扩增混合液:Eco R I引物0.7 μL(50 ng·μL-1)和 Mse I引物0.7 μL(50 ng ·μL-1)，dNTPs 0.5 μL(10 mmol·L-1)，10 ×反 应 缓 冲 液 2.5 μL(100 mmol·L-1Tris-HCl［pH 9.0］，80 mmol· L-1(NH4)2SO4，100 mmol·L-1KCl，NP-40)，Mg2+2 μL(25 mmol·L-1)，Taq 酶0.2 μL(5 U·μL-1)，无菌纯水15.9 μL。混匀后，按如下PCR程序扩增:94℃变性30 s，56℃复性30 s，72℃延伸1 min，共21个循环。取5 μL预扩增产物在1%琼脂糖上电泳，用EB染色，Bio-RAD凝胶成像系统显示。预扩增产物稀释20～50倍，-20℃保存备用。

1.2.5 选择性AFLP扩增

取2.5 μL稀释后的预扩增混合液，加入17.5 μL选择性扩增混合液:Eco R I选择性扩增引物0.1 μL(50 ng·μL-1)和Mse I选择性扩增引物0.6 μL(50 ng ·μL-1)，dNTPs 0.4 μL(10 mmol·L-1)，10 × 反应缓冲液2 μL(100 mmol·L-1Tris-HCl［pH 9.0］，80 mmol·L-1(NH4)2SO4，100 mmol·L-1KCl，NP-40)，Mg2+1.6 μL(25 mmol·L-1)，Taq 酶0.2 μL(5 U·μL-1)，无菌纯水12.6 μL。混匀后，按如下PCR程序扩增:94℃预变性2 min后;94℃变性30 s，64℃复性 (每循环降低0.7℃)30 s，72℃延伸1 min，12个循环后;94℃变性30 s，56℃复性30 s，72℃延伸1 min，28个循环;最后72℃延伸7 min。反应结束后向选择性扩增产物中加入等体积的上样缓冲液(98%甲酰胺，10 mmol·L-1EDTA［pH 8.0］，0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯腈)，98℃变性6 min，立即置于冰上冷却，待用。

1.2.6 扩增产物聚丙烯酰胺电泳分析

经预电泳 (40 W恒功率)30 min后，取5 μL上样混合物于6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分析 (40 W恒功率)，电泳至二甲苯腈指示带位于同一预定位置时终止。

1.2.7 银染成像

按照 Ceatano-Anolles等［8］的方法染色。

1.2.8 数据处理

根据各番茄品种基因组DNA的AFLP标记检测结果，选取清晰可辨的扩增条带用于数据统计分析。分别以1和0代表在某一迁移率处有或无扩增片断 (谱带)出现，将获得的AFLP指纹图谱转换为1和0构成的数字矩阵，计算各品种中出现的所有迁移率不同的扩增谱带数目、多态性谱带数目及其比例、品种间的共有谱带率等的各项参数。其中共有谱带率 (BS-Band Sharing)的计算公式［9］为:BS=2 Nab/(Na+Nb)，公式中Nab表示A与 B 2个品种的共同谱带数，Na、Nb则分别表示 A与 B 2个品种各自的总谱带数。

2 结果与分析

2.1 AFLP技术效果

实验通过对引物的筛选，初步筛选出6对AFLP选择性引物，并对8个番茄材料及4个番茄品种进行AFLP分析，都得到了清晰的指纹，并且所有的材料均表现出多态性，这可从引物组合EACA/M-CTA的指纹 (图1)情况看出。

图1 12个番茄材料的AFLP指纹图谱

6对引物的扩增结果 (表2)显示:共扩增了130条带，平均每对引物扩增21.2条带，其中有多态性条带80条，平均每对引物扩增多态性带13.3条，多态性比例62%。不同引物组合揭示多态性的能力有差别。引物E-ACC/M-CTG扩增的多态性条带最少，为8条，对供试番茄材料的区分率为50%;而E-ACA/M-CTA扩增的多态性条带最多，为24条，多态性比例高达75%，对供试番茄材料的区分率为100%。

2.2 AFLP指纹分析

2.2.1 8个番茄材料的分析

表2 6对AFLP引物对12个番茄材料的扩增结果

根据6对引物的指纹情况，随机选择了8个番茄材料18对组合进行比较。18对番茄材料间的共有谱带率 (BS)分析结果 (表3)表明，这些番茄材料间的BS大小的变化范围为54%～93%，平均为82%。根据以往的报道，BS值越大则其遗传关系越近，而BS值越小则遗传关系越远，进行遗传改良的潜力越大，遗传差异大的品种更适于作为育种亲本材料。实验结果证明了AFLP筛选番茄亲本的有效性。

表3 8个番茄材料间的共有谱带率

2.2.2 指纹图谱构建与品种鉴定

以应用 E-ACG/M-CTG、E-ACG/M-CAT和 EACA/M-CTA引物构建的6个番茄品种的AFLP指纹图谱 (图2)为例，3对引物共扩增出45条带，其中多态性带18条，占40%，对6个番茄品种的区分率达100%，可成为AFLP技术鉴定这些番茄品种的依据。

图2 6个番茄材料的AFLP指纹图谱

研究还发现，一些扩增带仅在部分番茄品种中出现，例如图2条带 b、c、d与 h只出现在9179中，一旦这些条带被确认具有品种的特异性，即可通过特征指纹快速鉴别番茄品种，从而大大提高鉴定效率。

3 小结与讨论

DNA分子标记是基因型在DNA水平上的表现形式，代表着品种间本质的差异，是继形态标记、生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记。为加快DNA分子标记技术在番茄育种实践中的应用，提高育种水平，人们已成功地将RAPD［9-10］(随机扩增多态 DNA)、SSR(简单序列重复)［11］及 AFLP技术应用于番茄的遗传关系［12］、品种鉴定［13］等方面的研究。

利用分子标记可以确定亲本之间的遗传差异和亲缘关系，指导杂交育种亲本选配［14］，减少杂交组合数［15］，有效划分杂种优势群［16］，为提高育种效率提供有效手段。通过亲缘关系分析，可以纠正形态分类中一些不恰当的结论以及目前育种工作中存在的一些问题。本研究的初步分析结果表明，不同番茄材料间AFLP指纹的BS值存在明显的差异，因此可以利用DNA指纹计算个体或品种间的BS值，以此估计它们之间的遗传距离，作为育种亲本选择的参考。

用AFLP方法得到的指纹图谱具有稳定可靠且多态性丰富的优点，非常适合于品种鉴定等方面的应用。本研究采用6对引物对6个番茄品种进行的AFLP分析，能够产生较为丰富的多态性以及稳定的AFLP标记，可区分6个番茄品种，并可作为6个番茄品种鉴定的依据。本研究建立的是一个利用DNA指纹来进行番茄品种鉴定的模型，虽然仅研究了6个番茄品种，然而研究的品种数量是可以增加的，而且随着品种和所用引物数量的增加，得到的结果会更准确。利用本研究建立的方法可以为保护番茄育种产权、登录新品种、鉴定和检测苗木真实性和纯度等提供客观、科学和准确的技术保障。

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