不同植物生长调节物质和培养基对浙江雪胆组培苗繁殖系数的影响

雷祖培，余宏傲，张书润，林瑞丰，康华靖

（1.浙江乌岩岭国家级自然保护区 管理局，浙江 泰顺 325500；2.温州科技职业学院 园林系，浙江 温州 325006）

浙江雪胆Hemsleya zhejiangensis为葫芦科Cucurbitaceae雪胆属Hemsleya多年生攀援草本，仅分布于浙江温州泰顺乌岩岭海拔800 m以下的山谷灌丛中和竹林下，为浙江特有种[1]。浙江雪胆块茎具有清热解毒、消肿止痛之功效，广泛用于治疗肠炎、菌痢、冠心病、气管炎、慢性子宫颈炎、带状疱疹、肿瘤等多种疾病[2-4]。因其疗效好，副作用低，因而在医学上日益受到青睐，应用前景十分广阔。目前，对浙江雪胆的研究较少，哀建国等[5]对浙江雪胆群落学特征进行了调查研究；雷祖培等[6]对浙江雪胆体内几种金属元素分布及其与土壤养分之间的关系进行了研究；叶晓霞等[4]探讨了超声提取——分光光度法测定浙江雪胆中总皂苷含量；叶晓霞等[7]从药用角度测定浙江雪胆块茎中的微量元素，证明浙江雪胆中含有丰富的人体必需微量元素，且微量元素的含量明显高于中华雪胆，这为浙江雪胆的进一步的开发利用提供了科学依据。由于浙江雪胆种群稀少，使用茎蔓扦插繁殖母本数量极少，扦插繁殖速度慢，同时容易受季节限制，严重阻碍了以这一新药源植物的生产利用。本研究主要通过研究浙江雪胆的初代培养基和最佳植物生长调节物质配比对其增殖的影响，以进一步为块茎的快速诱导和增殖打下良好的基础，最终实施人工栽培，以解决其资源匮乏和物种的有效保护。

1 材料与方法

1.1 材料

浙江雪胆块茎于2008年12月采自浙江乌岩岭国家级自然保护区内竹林下的雪胆群落，栽植于装有腐殖质土的花盆中，待长出幼苗后，采集具芽的幼嫩茎段作为外植体。试验于2009年2月至2010年5月在温州科技职业学院农生系生物工程研究所植物组织培养实验室中完成。

1.2 试验方法

剪取茎段，用洗涤剂涮洗后自来水冲洗1 h，再用蒸馏水冲洗3次，然后在超净工作台中进行操作。用体积分数为70%乙醇浸泡30 s，100.0 g·kg-1次氯酸钠浸泡8 min进行杀菌。消毒后的幼嫩茎段用无菌水浸洗5次，剪去基部，留1 cm左右的茎段，插栽在固体MS（Murashige and Skoog）基本培养基（蔗糖30.0 g·kg-1，琼脂6.0 g·kg-1，pH 5.8）中，插入深度2～3mm。 在 （25±2）℃组培室中培养。7 d后除去污染瓶，继续培养，21 d时转接，然后进行以下植物生长调节物质和培养基对浙江雪胆组培苗繁殖系数影响的研究。

1.2.1 6-苄基氨基腺嘌呤（6-BA）对浙江雪胆组培苗繁殖系数的影响 以MS为基本培养基，附加α萘乙酸（NAA）0.02 mg·L-1，酸碱度整为pH 5.8～6.0；蔗糖为30.0 g·L-1，琼脂作凝固剂。设置质量浓度分别为0， 0.10， 0.20， 0.50， 1.00， 2.00， 5.00 和 10.00 mg·L-1。

1.2.2 NAA对浙江雪胆组培苗繁殖系数的影响 以MS为基本培养基，附加6-BA 1.00 mg·L-1，设置质量浓度分别为 0， 0.01， 0.05， 0.10， 0.50和 1.00 mg·L-1。

1.2.3 不同质量浓度NAA和6-BA配比对繁殖系数的影响 以MS为基本培养基，附加6-BA和NAA，均设置5个质量浓度（2.00，1.00，0.50，0.10和0 mg·L-1）组合进行不同配比试验。1.2.4 不同基本培养基对繁殖系数的影响 分别以MS，B5，N6和WPM（woody plant medium）等4种培养基为基本培养基，附加植物生长调节物质6-BA 1.00 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1进行培养试验。

在光照强度为2000 lx左右，光照时间为10 h·d-1的培养室中进行恒温（25±2）℃培养35后，记录不同处理下浙江雪胆生长情况和繁殖系数。繁殖系数是指在一次继代培养中，由一个繁殖单位（嫩茎、芽、或芽丛等）产生的新苗 （芽）个数。以上实验均设5个重复，求其平均数。

表1 6-BA对浙江雪胆组培苗繁殖系数的影响Table1 Effect on the propagation coefficient of Hemsleya zhejiangensis of 6-BA

2 结果与讨论

2.1 6-BA对浙江雪胆组培苗繁殖系数的影响

不同6-BA质量浓度对浙江雪胆组培苗的繁殖系数影响较大，不同质量浓度之间差异都达到显著水平 （表1）。 在质量浓度 0.1～10.00 mg·L-1范围内，浙江雪胆组培苗的繁殖系数随6-BA质量浓度的升高而呈现先升高后下降的趋势，在0.50 mg·L-1时其繁殖系数最大，达到10.80；其次为1.00 mg·L-1，其值达到 6.80；再次为 0.20 mg·L-1和 2.00 mg·L-1； 其余质量浓度下浙江雪胆组培苗的繁殖系数较低。

2.2 NAA对浙江雪胆组培苗繁殖系数的影响

浙江雪胆组培苗的繁殖系数在NAA质量浓度为0 mg·L-1时，组培苗的繁殖系数为1.0；在低质量浓度（小于0.20 mg·L-1）下，其繁殖系数随着NAA质量浓度的升高而增大，在0.20 mg·L-1时其值最大，达到5.6（表2）；当NAA质量浓度增加至0.50 mg·L-1时，浙江雪胆组培苗的繁殖系数开始受到抑制。

2.3 不同质量浓度的NAA和6-BA配比对浙江雪胆组培苗繁殖系数的影响

不同质量浓度的NAA和6-BA配比对浙江雪胆组培苗繁殖系数的影响结果见表3。试验表明：最适宜于浙江雪胆组培快繁的芽分化诱导培养基配方为MS+6-BA 1.00 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1和MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1。2种配方下的浙江雪胆组培苗繁殖系数无显著差异。

表2 NAA对浙江雪胆组培苗繁殖系数的影响Table2 Effect on the propagation coefficient of Hemsleya zhejiangensis of NAA

表3 6-BA和NAA不同质量浓度配比对浙江雪胆组培苗繁殖系数的影响Table3 Effect on the propagation coefficient of Hemsleya zhejiangensis of 6-BA and NAA

2.4 不同基本培养基对浙江雪胆组培苗繁殖系数的影响

以WPM，B5，N6和MS为基本培养基对浙江雪胆组培苗繁殖系数的影响见表4。不同培养基下浙江雪胆组培苗繁殖系数均较高，其中以MS培养基的效果最佳，其繁殖系数达到16.80，与其他3种培养基相比，其差异达到了显著水平。

表4 不同培养基对浙江雪胆组培苗繁殖系数的影响Table4 Effect of basic medium on the propagation coefficient of Hemsleya zhejiangensis

3 讨论和结论

试验表明：在没有植物生长调节物质处理下，浙江雪胆组培苗繁殖系数均为1.00；不同6-BA和NAA质量浓度对其组培苗繁殖系数有较大影响，最佳质量浓度分别为0.50 mg·L-1和0.20 mg·L-1，其繁殖系数分别为10.80和5.60；6-BA对浙江雪胆丛生芽分化的促进作用显著高于NAA。不同质量浓度的NAA和6-BA配比的最佳配方为MS+6-BA 1.00 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1和 MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1， 2 种配比下组培苗繁殖系数分别为19.30和18.10，与单一植物生长调节物质最佳质量浓度下相比，其差异也均达到了显著水平。

通过试验观察，25～35 d为1个继代周期是较为适宜的，因为这个时期诱导的效果可以充分表现出来，而培养基的成分还没有完全变化到影响组织的生长，并且可为转接提供较大量的材料。浙江雪胆对组织培养的培养基成分的要求并不严格，基本培养基MS，B5，N6和WPM均可作为组织培养的基本培养基，都可满足浙江雪胆生长的需要，就快速繁殖而言，MS和B5培养基是比较适宜的培养基。

植物组织培养再生小植株一般有3条途径：一是外植体先形成愈合组织，愈合组织分化出不定芽，由不定芽再发育成小植株；二是由外植体表面直接诱导产生小鳞茎或小芽，再由小鳞茎或不定芽发育成小植株；三是由组织表层和内层一些特化了的胚性细胞经多次分裂发育成胚状体而形成小鳞茎，小鳞茎再形成小植株。本实验采用第1种途径，该方法较易进行，但繁殖周期较长。本实验发现除了以上3种增殖方式外，浙江雪胆的组培苗在初代培养（2009年2月）中不经生根阶段就可形成微型块茎（2009年9月）（图1），且该微型块茎可直接发育成新个体。此法如能和茎尖培养结合起来，将为浙江雪胆脱毒种块茎的繁育建立很好的体系。但是第2年（2010年）继代培养则未发现微型块茎的形成，推测与取样时间和部位相关，具体原因尚需进一步研究。

图1 分别为浙江雪胆的花、块根、初代培养幼苗和愈合组织Figure1 Hemsleya zhejiangensis： flower， tuber， initial culture seedling and callus

[1]胡绍庆，丁炳扬，陈征海.浙江省珍稀濒危植物物种多样性保护的关键区域[J].生物多样性，2002，10（1）：15-23.HU Shaoqing， DING Bingyang， CHEN Zhenghai.The critical regions for conservation of rare and endangered plant species diversity in Zhejiang Province [J].Biodiversity Sci， 2002， 10 （1）： 15-23.

[2]施亚琴，杨培金，王化远，等.巨花雪胆中的两种皂甙[J].华西药学杂志，1995，10（2）：90-92.SHI Yaqin， YANG Peijin， WANG Huayuan， et al.Two saponins isolated from Hemsleya gigantha [J].West China Pharmaceut Sci， 1995， 10 （2）： 90-92.

[3]陶朝阳，易杨华，林厚文，等.雪胆根抗肿瘤活性成分研究[J].第二军医大学学报，1999，20（5）：337-339.TAO Zhaoyang， YI Yanghua， LIN Houwen， et al.Study of activity component to antineoplastic in Hemsleya sinesis’s root[J].Acad J Sec Mil Med Univ， 1999， 20 （5）： 337-339.

[4]叶晓霞，丁立生，黄可新.超声提取-分光光度法测定浙江雪胆中总皂苷含量[J].天然产物研究与开发，2006，18（4）： 631-633， 662.YE Xiaoxia， DING Lisheng， HUANG Kexin.Studies on determination of the total saponins in Hemsleya zhejiangens[J].Nat Prod Res Dev， 2006， 18 （4）： 631-633， 662.

[5]哀建国，俞琳，章丽英，等.浙江雪胆群落学特征研究[J].浙江林学院学报，2007，24（6）：706-710.AI Jianguo， YU Lin， ZHANG Liying， et al.Plant community properties in a Hemsleya zhejiangensis habitat in Wuyanling Nature Reserve， Zhejiang Province [J].J Zhejiang For Coll， 2007， 24 （6）： 706-710.

[6]雷祖培，张书润，康华靖，等.浙江雪胆几种金属元素分布及其与土壤养分之间的关系 [J].中国野生植物资源，2010， 29 （4）： 48-52.LEI Zupei， ZHANG Shurun， KANG Huajing， et al.Element distribution and its relationship with soil nutrients of Hemsleya zhejiangensis[J].Chin Wild Plant Resour， 2010， 29 （4）： 48-52.

[7]叶晓霞，蒋绛雪，艾常春，等.ICP-AES法测定浙江雪胆中的微量元素[J].广东微量元素科学，2005，12（9）：26-29.YE Xiaoxia， JIANG Jiangxue， AI Changchun， et al.Determination of trace elements in Hemsleya zhejiangensis[J].Guangdong Trace Elem Sci， 2005， 12（9）： 26-29.