梓醇改善东莨菪碱诱导的学习记忆障碍及机制研究

王红利，薛莉君，万 东，祝慧凤，徐晓玉

(1.西南大学药学院暨中医药学院，重庆 400715;2.重庆市药效评价工程技术中心，重庆 400715;3.重庆医科大学附属第一医院，重庆 400016)

梓醇是滋阴补髓中药地黄的主要活性成分之一，具有神经保护、抗炎、利尿、降血糖、抗癌、以及抗肝炎病毒等药理作用［1-2］。前期研究发现梓醇具有明显的脑保护效应，促进中风大鼠神经功能恢复，促进轴突生长蛋白GAP43表达［3］，有利于缺血性中风后神经血管结构和功能的重塑［4］。课题组在观察梓醇对中风大鼠神经行为学功能的影响，用残肢抓取食物的实验时发现:食物所放位置是相对固定的［5］，梓醇治疗组中风大鼠最先找到食物。基于以上的实验发现，本实验通过腹腔注射丁溴东莨菪碱复制记忆障碍模型［6］，选用 Morris 水迷宫［7-8］来测试梓醇对东莨菪碱所致学习记忆障碍的影响，并采用ELISA定量检测大脑ACh和BDNF的含量，以期阐明其可能的作用机制，为梓醇治疗中风、记忆障碍等相关疾病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1动物与分组昆明种小鼠70只，♀♂各半，体质量22～28 g，购自重庆医科大学实验动物中心(合格证号:检动字2002A040)。经训练3 d，筛选出逃避潜伏期无差异小鼠56只，选取40只，♀♂各半，随机分为4组:正常组、模型组(东莨菪碱，2 mg·kg-1)、奥拉西坦组(阳性药物、105 mg·kg-1)和梓醇治疗组(9 mg·kg-1)，每组10只。

1.2药物和试剂梓醇(购自石家庄流波百鸟生物技术有限公司)，奥拉西坦(广东世信药业有限公司，规格5 ml:1.0 g，批号1001024)，丁溴东莨菪碱(购自海南双成药业有限公司，规格20 mg，批号20090211)，ACh(CK-E20536M)和 BDNF(CKE20084M)含量ELISA试剂盒均购自美国Rapidbio(RB)公司。

1.3主要仪器Morris水迷宫仪(成都泰盟科技有限公司)，EL-204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，H1650-W台式微量高速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，722型紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)，550型全自动酶标仪(美国BioRad公司)。

1.4药物干预70小鼠连续3 d进行Morris水迷宫训练与测试，淘汰逃避潜伏期有明显差异的小鼠后，从中选取40只随机分为4组(n=10):正常组、模型组(丁溴东莨菪碱)、奥拉西坦组(105 mg·kg-1)、梓醇治疗组(9 mg·kg-1)。所用药物均用生理盐水稀释，给药剂量换算为10 ml·kg-1，均采用尾静脉注射给药，除模型组注射生理盐水外，其余两组分别同时注射奥拉西坦105 mg·kg-1，梓醇9 mg·kg-1，每日1 次，连续 3 d。

1.5水迷宫记忆训练与测试测试之前，除正常组腹腔注射生理盐水外，其余各组小鼠均腹腔注射丁溴东莨菪碱，造成小鼠记忆障碍模型［6］，然后进行水迷宫测试。Morris水迷宫由圆形水池和自动录像及分析系统两部分组成。圆形水池(直径80 cm，高30 cm)加水后用黑墨水滴成黑色使水不透明，且将迷宫均分为4个象限，水温保持在25℃左右。另有一个黑色圆形平台(直径10 cm，高28 cm)，置于某一个象限中央，位于水面下1～2 cm左右。测试时，选择象限作为入水点，将小鼠面向池壁放入水中，根据水迷宫跟踪系统记录动物寻找并爬上平台所需时间，即逃避潜伏期(escape latency)，120 s内未找到平台则将动物引至平台，逃避潜伏期记为120 s。实验进行3 d，每只小鼠每天训练4次(包括4个象限入水点)，且将小鼠引至平台后在平台上停留10 s。

1.6ELISA检测脑ACh和BDNF含量水迷宫测试结束后，将各组小鼠快速断头取脑，于冰盘上分离大脑皮质和海马，精确称重，将皮质与海马用生理盐水按 1 ∶9 比例制成冰浴匀浆［10］，4 000 r·min-1，4℃离心10 min，取上清液作为待测样品备用。按照ELISA试剂盒说明书实验步骤测定ACh和BDNF含量。

1.7统计学处理数据采用±s表示，采用SPSS11.0统计软件进行分析。各组间逃避潜伏期采用方差分析。

2 结果

2.1梓醇改善东莨菪碱诱导的记忆障碍Morris水迷宫实验结果，与正常组相比，各组使用2 mg·kg-1东莨菪碱后，小鼠的潜伏期明显延长(104.85± 32.13vs88.9 ± 21.47，P＜0.05)，表明 2 mg·kg-1东莨菪碱成功复制小鼠学习记忆障碍;经药物治疗后，梓醇组和奥拉西坦组均明显缩短小鼠的逃避潜伏期(104.85±32.13vs73.12 ±21.13vs87.24±25.35，P＜0.05)，但与正常组比较差异无显著性(P＞0.05);梓醇组与奥拉西坦组比较，小鼠的逃避潜伏期差异无显著性(P＞0.05)。实验结果如Fig 1。

2.2梓醇对小鼠大脑(皮质与海马)脑源性神经元营养因子(BDNF)和乙酰胆碱(ACh)水平的影响与模型组相比，梓醇组小鼠大脑皮质和海马BDNF含量明显增加(304.12±49.01vs230.1±35.76，P＜0.01);梓醇组小鼠大脑皮质和海马ACh含量明显增加(570 ±59.18vs446.6 ±32.18，P＜0.01)。梓醇组和奥拉西坦组小鼠大脑皮质和海马BDNF及ACh含量均超过正常组，梓醇组和奥拉西坦组ACh含量和BDNF含量组间比较差异无显著性(P＞0.05)，表明梓醇与奥拉西坦具有相似的改善学习记忆机制。

Fig1 Effects of catalpol on escape latency in amnesia mice evaluated by Morris water maze test

Fig 2 Effects of catalpol on ACh and BDNF of hippocampus and cortex in amnesia mice induced by scopolamine

2.3BDNF和ACh相关性分析如 Fig 3，BDNF与ACh的含量可能有相关性(r=0.61，P＜0.05)，表明梓醇有改善丁溴东莨菪碱诱导的学习和记忆机能障碍，其促进BDNF的表达与胆碱能系统尤其是ACh含量相关，BDNF与ACh有密切的联系。

3 讨论

学习记忆能力的优劣直接影响很多疾病的康复过程。中风、痴呆等老年疾病常常伴有学习记忆能力的下降。中风后患者学习记忆能力的增强有利于患者语言、肢体精细感觉运动的学习和功能恢复，同时痴呆患者学习记忆能力的改善也明显提高患者生活质量，因此寻找到既能有利于中风等疾病的治疗，同时又能够促进学习记忆的有效药物，将是医药学界一大幸事。

Fig 3 Correlation between ACh and BDNF(r=0.61，P ＜0.05)

学习和记忆机制涉及复杂的神经生理和生化机制，尤其是胆碱能系统与学习记忆关系密切［9-10］。大脑有诸多机制用于记忆存储，而ACh水平是这一过程的关键因素［11］。研究表明脑部释放的神经递质——ACh的多少决定了记忆的细节程度［11］。高水平的ACh能帮助大脑记忆更多细节。梓醇提高大脑皮质和海马ACh含量，至少表明梓醇改善学习记忆影响了乙酰胆碱能系统，梓醇提高脑ACh浓度可能有利于细节记忆，将对记忆类疾病的治疗带来影响。

脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养因子家族中的重要成员，富集于大脑皮质和海马等区域，也是记忆形成过程中的关键蛋白之一。越来越多的研究证实:BDNF是在记忆形成过程中的关键蛋白［12-14］。老年疾病如老年性痴呆症与帕金森综合症［15-16］，患者大脑皮质海马BDNF蛋白质及其受体TrkB的合成和分泌均明显减少。研究表明BDNF及其受体参与海马学习记忆的过程:①BDNF通过基底前脑胆碱能系统调节学习记忆:BDNF可以通过其受体Trk-B促进ACh的释放，同时受PKC信号通路的调控［17-20］，参与神经突触可塑性调节，影响学习记忆过程;②BDNF通过调节突触传递易化长时程增强(LTP)。而且一定剂量的BDNF有助于克服恐惧，消除痛苦记忆［15-16］，将有助于疾病如中风后良性记忆的恢复，对心理的良性作用是不言而喻的。本研究结果表明梓醇促进大脑皮质和海马BDNF的分泌，可能会通过其受体TrkB调节ACh合成、分泌和释放，从而改善学习记忆障碍小鼠学习记忆能力。从BDNF与ACh两参数相关性分析结果看，梓醇促进BDNF与ACh分泌具有较为明显的相关性，更进一步证实了上述推测。

目前的文献支持梓醇是一种神经血管单元保护剂，不仅治疗中风疾病［4，21］，而且对于多种老年疾病［22-24］、神经退行性疾病都具有治疗潜能，因此具有重要的研究和开发价值。本研究初步证实了梓醇提高了学习记忆障碍模型小鼠大脑ACh和BDNF的浓度，且二者具有良好的相关性，但梓醇影响ACh合成、分泌、代谢通路的具体环节还不清楚，这将是课题组下一步探讨的课题。

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