纹状体内单侧注射6-羟多巴制备小鼠帕金森病模型

付爱玲，王逸麟

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种临床常见的神经退行性疾病。PD的病理特征主要是中脑黑质致密部，出现明显的多巴胺神经元缺失，导致其靶组织纹状体内多巴胺水平降低，从而引起运动失调和认知功能障碍。

在啮齿类动物模型中，大鼠前脑内侧束(median forebrain bundle，MFB)内单侧注射 6-羟多巴(6-hydroxydopamine，6-OHDA)制备的PD模型得到了广泛的应用［1］。然而，这个模型存在的主要问题是成功率较低，平均30% ～40%。小鼠腹腔注射神经毒素 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)也用以制备PD模型［2］，但MPTP注射引起的是双侧PD症状，不能进行基于一侧损伤所产生的行为学检测［3］。6-OHDA能够选择性地破坏儿茶酚胺类神经元，单侧脑内注射后，通过检测单侧偏倚，易于评估运动损伤［4］。另外，6-OHDA能够阻断脑内的黑质纹状体通路，导致多巴胺能神经元的退化，在较长的时间内可产生稳定的运动损伤，有利于筛选有效药物［5］。

至今在国内尚未见小鼠6-OHDA脑内注射制备PD模型的报道。可能的原因是小鼠MFB区域较小，难以进行局部脑内注射。本研究中，我们将6-OHDA单侧注射入小鼠脑区面积较大的纹状体内，使用与大鼠PD模型相同的方法进行行为学检测和生化指标测定，并与大鼠PD模型进行对比实验。结果表明，小鼠6-OHDA单侧纹状体内注射可成功制作急性PD模型，成功率为95%，持续时间大约4周。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 健康♂SD大鼠(200～250 g)和C57BL/6小鼠(25～30 g)，重庆医科大学动物中心提供。6-羟多巴氢溴酸(6-hydroxydopamine hydrobromide，6-OHDA·HBr)、阿朴吗啡、安非他命、NADPH、四氢叶酸、过氧化氢酶、Fe(NH4)2(SO4)2和L-酪氨酸均购自Sigma公司。3H-L-酪氨酸和Ultima gold闪烁液购自Perkin Elmer公司。其他试剂均为分析纯。6-OHDA·HBr临用前溶解在0.02%抗坏血酸溶液中，终浓度为3 g·L-1。

1.2 小鼠单侧纹状体内注射6-OHDA制备PD模型 小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.01 ml·g-1)。将动物固定在立体定位仪上，沿颅顶正中矢切开皮肤，脱脂棉轻轻搽拭暴露前囟(Bregma)。在前囟后1.0 mm、中线旁2.1 mm，以及前囟后0.3 mm、中线旁2.3 mm处打孔。分别用微量进样器缓慢注入6-OHDA·HBr溶液2 μl(颅骨下2.9 mm)，注射后留针1 min，退出进样器，缝合处理创面。

1.3 大鼠PD模型的制备 将大鼠预先腹腔注射去甲丙咪嗪(25 μg·g-1)。然后腹腔注射水合氯醛麻醉后，将动物固定于脑立体定位仪。沿颅顶正中矢切开皮肤，3%过氧化氢溶液去除皮下粘膜。于前囟后-4.0 mm、中线旁1.6 mm处开颅。微量进样器插入左侧前脑内侧束。在给予去甲丙咪嗪30min后，微量进样器注射入6-OHDA溶液4 μl(颅骨下8.0 mm)，注射速度为0.5 μl·min-1。注射后留针8min后缓慢退出进样器，缝合创面。

1.4 动物行为测试 在手术后的1～5周，腹腔注射1 μg·g-1阿朴吗啡(0.5 g·L-1)，将动物放于40 cm直径的圆底锅内，计数20 min内动物向给药对侧旋转的圈数(旋转360度计为一圈)。在给予阿朴吗啡的d 1，腹腔注射2.5 μg·g-1的安非他命(0.5 g·L-1)，计算20 min内动物向给药侧旋转的圈数。旋转次数以每分钟圈数(rotation·min-1)表示。

1.5 酪氨酸羟化酶活性测定 采用同位素法进行测定动物皮层和纹状体内酪氨酸羟化酶的活性［6］。脱臼处死小鼠，取出大脑，快速分离皮层、左右侧纹状体。测定时按照1∶10的比例加入磷酸缓冲液，冰浴中匀浆。于200 μl匀浆液中加入100 μl反应液(磷酸缓冲液中含有11.8 g·L-1NADPH，7.6 g·L-1四氢叶酸，233 g·L-1过氧化氢酶，10 mmol·L-1Fe(NH4)2(SO4)2，1.5 mmol·L-1L-酪氨酸，5.18 × 105Bq3H-L-酪氨酸)。混匀后在37℃ 孵育30 min，加入1.0 ml的7.5%活性碳终止反应。离心，吸取200 μl上清液，转移到液闪瓶中，加入10 ml Ultima gold闪烁液，混匀，于液闪计数器上进行测定。匀浆液蛋白含量用Lowry法测定。酪氨酸羟化酶活性以nmol·h-1·g-1Pro表示。

2 结果

实验共使用了20只C57/BL小鼠和20只SD大鼠。小鼠手术后有1只在1周内死亡，总成功率为95%;SD大鼠，9只未成功，2只大鼠手术后1周内死亡，成功率为45%。

2.1 阿朴吗啡诱发的旋转 大鼠给予6-OHDA后1周，动物开始出现旋转行为，随着时间延长，旋转次数逐渐增多。一般认为，平均每分钟旋转7次以上者，被认为是成功的PD模型。小鼠注射6-OHDA后也出现了明显的旋转行为，第2周时，平均每分钟旋转次数已达到9次以上(9.9±1.0)，但第3周后，次数开始下降，至第5周下降至7.5次(7.5±0.9)(Fig 1)。这个结果表明，小鼠注射6-OHDA制备的PD模型能够持续4周左右，可用作PD的急性模型。

Fig 1 Comparison of apomorphine-induced rotation between rats and mice

2.2 安非他命诱发的旋转 安非他命诱发动物旋转的实验结果与阿朴吗啡相似。小鼠注射6-OHDA第2周，旋转次数已达到7次以上，第3周时开始下降，至第5周时下降至5.1次(Fig 2)。这个结果确定，小鼠注射6-OHDA制备的PD急性模型是稳定的，对不同的所试药物均可出现相应的反应。

Fig 2 Comparison of amphetamine-induced rotation between rats and mice

2.3 皮层和纹状体内TH活性的测定 结果显示，大鼠左侧(未注射侧)纹状体内TH活性正常，而注射侧TH活性明显降低。这与文献报道一致［7］。小鼠注射6-OHDA后，实验结果与大鼠相似(Fig 3)。表明小鼠单侧纹状体内注射6-OHDA后，可引起了多巴能神经元损伤，导致TH活性下降。

3 讨论

大鼠MFB内注射6-OHDA是常用的PD模型。但该模型成功率较低。原因可能是MFB区域比较狭窄，对操作的要求非常严格。6-OHDA单侧损毁制备PD模型的优势在于旋转症状可以量化，容易评价抗PD药物和治疗方法的疗效。

在一些药物研究中，使用小鼠比大鼠更加有利，因此我们选择小鼠进行PD模型实验。结果证明，小鼠注射6-OHDA制备的PD模型能够持续4周左右，可用作急性模型。该模型是稳定、有效，对不同的所试药物可出现相应的反应。推测国内常用的昆明种小鼠，也可能会出现相似的结果。

Fig 3 Measurement of TH activity in cortex，left and right striatum*P＜0.05 vs respective left striatum.

TH是儿茶酚胺类活性物质生物合成的限速酶，它的活性可作为多巴能神经元的指标［8］。本实验中，我们采用同位素法检测大鼠和小鼠皮层、左右纹状体内TH活性。结果表明，动物注射6-OHDA后，对皮层和非注射侧的纹状体内的TH活性没有影响，而注射侧的TH活性明显下降，说明动物的行为变化与TH活性下降有关。

总之，本文介绍的小鼠PD模型简单易行、成功率高，并且可出现与大鼠PD模型相似的行为学特征和生化指标的变化。以上结果证明，小鼠6-OHDA单侧纹状体内注射可用于制作急性PD模型。

［1］Wu S P，Fu A L，Wang Y X，et al.A novel therapeutic approach to 6-OHDA-induced Parkinson’s disease in rats via supplementation of PTD-conjugated tyrosine hydroxylase［J］.Biochem Bioph Res Co，2006，346(1):1-6.

［2］马 成，马 龙，RAUSCH Wolf-dieter.大花罗布麻对MPTP型小鼠的多巴胺能神经保护作用研究［J］.中国药理学通报，2010，26(3):397-400.

［2］Ma C，Ma L，RAUSCH Wolf-dieter.Dopaminergic neuroprotection of Poacynum hendersonni in MPTP mouse［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(3):397-400.

［3］Fox S H，Brotchie J M.The MPTP-lesioned non-human primate models of Parkinson’s disease.Past，present，and future［J］.Prog Brain Res，2010，184:133-57.

［4］Esposito E，Cuzzocrea S.New therapeutic strategy for Parkinson′s and Alzheimer’s disease［J］.Curr Med Chem，2010，17(25):2764-74.

［5］Cenci M A，Ohlin K E.Rodent models of treatment-induced motor complications in Parkinson’s disease［J］.Parkinsonism Relat Disord，2009，15(Suppl 4):S13-7.

［6］Fu A，Zhou Q，Hui E K，et al.Intravenous treatment of experimental Parkinson’s disease in the mouse with an IgG-GDNF fusion protein that penetrates the blood-brain barrier［J］.Brain Res，2010，1352:208-13.

［7］Zhang Y，Pardridge W M.Near complete rescue of experimental Parkinson’s disease with intravenous non-viral GDNF gene therapy［J］.Pharm Res，2009，26(5):1059-63.

［8］Khan H A.Analytical characterization of a sensitive radioassay for tyrosine hydroxylase activity in rodent striatum［J］.Neurochem Res，2004，29(8):1467-72.