烟曲霉抗原 Asp f16 HLA-A＊0201限制性的 CD8+CTL抗原表位生物信息学预测与实验室鉴定

赵作涛 孙铮 万喆 朱平 李若瑜

(1.北京大学第一医院皮肤性病科、北京大学真菌和真菌病研究中心,北京 100034;2.北京大学第一医院血液科,北京 100034)

近年来,随着免疫受损患者不断增多,侵袭性曲霉病 (Invasive Aspergillosis,IA)的发病率呈上升趋势,而且病情十分严重。在白血病和骨髓移植受者等重症免疫受损患者中,IA患者的病死率高达90%,已经成为此类患者死亡的主要原因之一,而烟曲霉是 IA最主要的致病真菌[1-5]。

目前临床主要还是以各种抗真菌药物作为 IA的主要治疗方法,鉴于 IA的患病率上升、病死率极高,而目前临床正面临着抗真菌药物副作用大、治疗效果不理想的险峻形势,进一步寻找更为有效的治疗方法成为目前急需解决的重要问题。大量研究表明细胞免疫,特别是 T细胞免疫在宿主清除烟曲霉感染中具有重要作用,T细胞免疫治疗 IA具有重要意义和广阔的应用前景[6-14]。免疫治疗 IA的最大困难在于烟曲霉的抗原成分十分复杂,筛选和鉴定合适的烟曲霉抗原表位,通过体外多肽抗原负载树突状细胞 (dendritic cells,DC)诱导抗原肽特异性 CTL产生,对于研究 CTL杀伤烟曲霉的机制和多肽疫苗的制备具有重要意义。因此,本文应用生物信息学手段对烟曲霉抗原 Asp f16进行分析,以国人常见的 HLA-A＊0201位点为靶点,对可能的 CTL抗原表位进行预测,合成多肽并制备多肽特异性 CTL,应用酶联免疫斑点法 (Enzymelinked immunosorbent assay,ELISPOT)技术检测CTL产生的能力,四聚体 (Tetramer)流式细胞仪技术检测抗原肽特异性 CTL,从而对生物信息学预测的抗原表位进行鉴定,为进一步研发新型抗烟曲霉T细胞疫苗提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象

HLA-A＊0201转基因小鼠 (C57BL/6背景)购自于美国 Jackson Laboratory,于 SPF环境养殖,转基因小鼠表达人类 MHC-I类分子 HLA-A＊0201[15]。

1.2 生物信息学预测烟曲霉抗原 Asp f16的 HLAA＊0201限制性 CTL抗原表位

利用文献报道及生物信息学资源,我们从 NCBI数据库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得烟曲霉抗原Asp f16(编码基因 crf1,GenBank entry AJ223327,Genomic locus Afu 1g16190)的全部 427个氨基酸序列,使用由美国国家生物技术中心 (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla bind/)和德国Tubingen大学免疫系 (http://www.syfpeithi.de/Scripts/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)提供的生物信息学软件扫描了烟曲霉抗原Asp f16的全部 427个氨基酸序列[16]。鉴于国人常见的 HLA位点是 HLA-A＊0201,我们选择了该位点作为靶点,根据与 HLA分子稳定性半衰期评分筛选出预测分数较高的 3条 9肽 (见表 1)。

表 1 抗原表位生物信息学预测结果Tab.1 Prediction of HLA peptides motif

1.3 多肽合成

根据生物信息学软件筛选结果,合成 3条HLA-A＊0201限制性 9肽 (P1,P2,P3)以及与烟曲霉无关的对照肽 (来源于血液肿瘤抗原核仁磷蛋白 NPM1,CLAVEEVSL)。4条多肽交予上海强耀生物科技有限公司 (ChinaPeptides Co.,Ltd.)合成,高效液相色谱仪 (HPLC)测定其纯度 >95%。1 mg多肽溶解在 20μL的 DMSO(sigma)中,每支EP管 5μL分装,-30℃冷冻保存。

1.4 HLA-A＊0201转基因小鼠 DC的制备

HLA-A＊0201转基因小鼠经脱颈椎处死,浸入75%酒精中。5 min后,在生物安全柜内无菌操作游离胫骨,置于无菌 PBS中。剪掉骨两端,使用RPMI 1640完全培养液 (Hyclone,含 10%胎牛血清,青霉素 100 U/mL,链霉素 100μg/mL,Gibco)反复冲洗骨髓腔,将获得的细胞悬液置于 RPMI 1640完全培养液中,37℃,5%CO2培养箱 (Thermo)孵育。4 h后轻柔吸去悬浮未贴壁的细胞,以RPMI 1640完全培养液轻柔冲洗 3遍,以除去未贴壁细胞。更换新的 RPMI 1640完全培养液,同时加入细胞因子 GM-CSF(R＆D,终浓度 20 ng/mL)和IL-4(R＆D,终浓度 10 ng/mL)。第 4天,全量更换1次 RPMI 1640完全培养液。第 5天,向培养体系加入 TNF-α(R＆D,终浓度 10 ng/mL)。第 7天 ,收获培养体系内的细胞。

1.5 成熟 DC的表型鉴定

收集培养第 7天的 DC,调整细胞浓度至 1×107/mL,与以下抗体孵育:FITC-Anti Mouse I-Ab(AF6-120.1),PE-Anti Mouse CD80(16-10A1);FITC-Anti Mouse CD11c(N418),PE-Anti Mouse CD86(GL-1)。对照抗体分别为:FITC-Mouse Ig2a κIsotype Ctrl(MOPC-173),PE-Armenian Hamster IgG Isotype Ctrl(HTK-888),FITC-Armenian Hamster IgGIsotype Ctrl(HTK-888),PE-Rat IgG2aκI-sotype Ctrl(RTK2758),全部抗体均购置美国 Biolegend公司。将 100μL细胞 (106)与荧光单抗于4℃反应 30 min,PBS洗 3次后流式细胞仪 (BD,LSR)检测表型。

1.6 成熟 DC的抗原肽负载

成熟 DC分为两组,分别加入 DMSO溶解的实验组多肽和对照肽组多肽,使其浓度皆为 50μg/mL,37℃,5%CO2条件培养 2 h,用无血清的 RMPI 1640培基洗涤 3次后,显微镜下计数,以 25 Gy放射当量辐照细胞,作为体外刺激 T细胞的抗原提呈细胞 (Antigen Presenting Cell,APC)备用。

1.7 抗原肽预先免疫的小鼠淋巴结细胞悬液的制备

初次免疫,无菌条件下将 1 mg实验组多肽抗原 (P1、P2、P3以 1∶1∶1的比例混合)以及对照肽分别溶于 10μL DMSO中,再溶于 0.5 mL PBS中,与 0.5 mL弗氏完全佐剂 (CFA;Sigma,St.Louis,MO)完全混匀。75%酒精棉球消毒 HLA-A＊0201转基因小鼠尾根部,尾根部左右两侧皮下分别注入抗原肽与弗氏佐剂混匀物约 50μL。

加强免疫,无菌条件下将 1 mg实验组多肽抗原以及对照肽分别溶于 10μL DMSO中,再溶于 0.5 mL PBS中,与 0.5 mL弗氏不完全佐剂 (IFA;Sigma,St.Louis,MO)完全混匀。初次免疫后 10～14 d,实施再次免疫。用 75%酒精棉球消毒其尾根部,在其尾根部左右两侧皮下分别注入抗原肽与弗氏佐剂混匀物约 50μL。

再次免疫后 7～10 d后,将小鼠经脱颈椎处死,浸入 75%酒精中。10 min后,在超净台内小心取出已经肿大的腹股沟淋巴结 (左右各 1个),置于 RPMI 1640培养液中备用。收集齐所有小鼠腹股沟淋巴结后,每组分别置于 150目筛网上,以 5 mL注射器活塞研磨,研磨过程中不时用培养液冲洗筛网,获得单细胞悬液。以 1640培养液,400 g,离心 10 min,调细胞浓度为 1×106/mL备用。

1.8 抗原肽特异性 CD8+CTL的制备

将辐照后的 DC与贴壁 4 h后的淋巴结细胞悬液中未贴壁细胞以 1∶10的比例混合均匀,RPMI 1640完全培养液,开始第一轮体外活化。5 d后换液,另外添加 IL-2(R＆D,终浓度 10 ng/mL),5 d后再次加入新制备的辐照后的 DC,开始第二轮的刺激。经过 3～4轮的体外刺激,并进一步使用红细胞裂解,死细胞去除试剂盒 (Dead Cell Removal Kit,Miltenyi Biotec,Germany),免疫磁珠负性分选CD8+T淋巴细胞 (CD8+TCell Isolation Kit,Miltenyi Biotec,Germany)得到纯度较高的抗原肽特异性T淋巴细胞群 (另文发表)。

1.9 抗原肽特异性 CD8+CTL的 Tetramer流式细胞仪检测

由荷兰 Sanquin公司设计并合成 P1,P2,P3表位特异性 PE-Tetramer。取 6组分选后的 CD8+CTL,每组 2 mL,细胞浓度为 1×106/mL。取其中3组作为实验组,300 g,10 min离心后,吸弃上清,加入 40μL含 0.5%胎牛血清的 PBS,分别与10 μL的 P1-PE-Tetramer、P2-PE-Tetramer、P3-PETetramer混合,在 18～25℃条件下孵育 20 min;再分别与 APC anti-mouse CD8a(clone 53-6.7,Biolegend)2μL混合,4℃条件下孵育 30 min。3个对照组的染色抗体为 APC-Rat IgG2a,κIsotype Ctrl(clone RTK2758,Biolegend)2μL混合,4℃条件下孵育 30 min。PBS洗涤 3遍后,300 g,10 min离心,各组皆调浓度 1×106/mL,4℃保存,流式细胞仪检测表型。

1.1 0 ELISPOT技术检测 CD8+CTL对特异性抗原刺激的反应

所用试剂盒为Mouse IFN-γPrecoated ELISPOT kit(达科为生物技术有限公司)。实验分组:APHA(sigma)阳性对照组 +抗原肽特异性 CD8+CTL;B-抗原肽特异性 CD8+CTL;C-抗原肽负载的树突状细胞 +抗原肽特异性 CD8+CTL;D-对照肽负载的树突状细胞 +对照肽特异性 CD8+CTL;E-空白树突状细胞 +抗原肽特异性 CD8+CTL;F-空白树突状细胞 +对照肽特异性 CD8+CTL。具体操作见参考文献[9]。

2 结 果

2.1 烟曲霉特异性抗原肽的生物信息学预测

在前期工作基础上,我们使用由美国国家生物技术中心和德国 Tubingen大学免疫系提供的生物信息学软件扫描了位于烟曲霉细胞壁的抗原 Asp f16的全部 427个氨基酸序列[16]。鉴于国人最常见的 HLA位点是 HLA-A＊0201,我们选择了该位点作为靶点,并根据与 HLA分子稳定性半衰期评分筛选并合成了 3条 9肽 (见表 1)。

2.2 体外培养小鼠骨髓造血干细胞来源的 DC及成熟 DC的表型鉴定

贴壁细胞在 mGM-CSF和 mIL-4培养 3 d时,DC数量明显增多,并有部分细胞悬浮,悬浮细胞有小的突起,出现大量半贴壁半悬浮的集落,集落表面的细胞有小的突起。第 4天,细胞增加更多,表面出现长长的树枝状突起。第 5天加入 TNF-α促使其成熟,至第 7天培养液中的大部分细胞已经基本成熟,成较大的圆球形,表面有刺状突起。培养 7 d的 DC,经过 4种荧光抗体的标记之后,显示表达各种标记抗体对应的表面分子细胞数量百分比为:MHCⅡ-32.80%,CD80-52.39%,CD11c-55.38%,CD86-43.15%,表明所培养的树突细胞已经达到相当程度的表型成熟。证实我们建立了稳定的树突状细胞的体外培养和诱导成熟体系 (见图 1)。

2.3 体外检测抗原肽特异性 CTL的研究

预先皮下免疫获得的引流淋巴结来源的 T细胞,经过 APC(负载抗原肽的树突状细胞)体外 2～4轮的刺激:第一轮前 5 d不加细胞因子 IL-2,目的是确保非特异性 T细胞死亡,以提高抗原特异性T细胞的纯度;从第二轮开始,细胞快速增殖,每隔1 d就要传代;至第 3～4周特异性 CTL达到一定纯度,经过溶红、去死、CD8阴选一系列处理之后,以 PE标记的 P1、P2、P3特异性四聚体和 APC标记的 CD8a荧光抗体共同染色。结果表明,CD8分子阳性率为 90%以上。Tetramer实验显示 P1、P2、P3的阳性表达率即 3种 9肽特异性 CTL所占的比率分别为 10.66%,7.29%,5.03%(见图 4)。因此,我们应用 Tetramer实验证实了烟曲霉 3种抗原肽与 HLA-A＊0201分子的亲和力 (见图 2)。

2.4 ELISPOT烟曲霉特异性抗原肽体外活化 T细胞的研究

我们应用 ELISPOT实验验证生物信息学预测的烟曲霉抗原多肽体外可以活化 CTL并产生细胞因子 IFN-γ。抗原提呈细胞与 CD8+CTL经过 20 h的作用,不同分组孔内产生细胞因子 IFN-γ的 T细胞的数量不同:①阳性对照组在低浓度丝裂原PHA的刺激下,一部分烟曲霉肽特异性 CTL分泌IFN-γ。②无 APC的刺激时,烟曲霉肽特异性 CTL几乎不分泌 IFN-γ,细胞数仅为 (4.0±3.6)spots/well。③在特异性 APC的刺激下,数量很多的烟曲霉肽特异性 CTL分泌 IFN-γ,高达 (266.0±39.2)spots/well。④在对照肽负载 DC刺激下,数量很多的对照肽特异性 CTL分泌 IFN-γ。⑤非抗原负载DC刺激下,很少数目的烟曲霉肽特异性 CTL分泌IFN-γ。⑥非抗原负载 DC刺激下,很少数目的对照肽特异性 CTL分泌 IFN-γ。具体数值见图 2。这些结果表明烟曲霉抗原肽和对照肽体外可以活化相应的 CD8+CTL并产生 IFN-γ(见图 3)。

3 讨 论

IA是一种主要由烟曲霉引起,通常侵犯免疫力受损人群的破坏性和致死率极高的恶性感染,病情的发展和转归取决于烟曲霉的侵袭力和宿主的抗真菌免疫能力之间的平衡[7,8]。通常情况下,人们每天都会吸入大量烟曲霉孢子,对于免疫力正常的宿主,以中性粒细胞和巨噬细胞为代表的固有性免疫与以 T淋巴细胞为主导的特异性免疫可以迅速将侵入体内的烟曲霉完全清除,而不发病[8]。然而对于免疫受损患者,不能及时彻底清除烟曲霉这种生长繁殖非常迅速的病原真菌,一旦感染,后果十分严重。

图 1 小鼠骨髓来源的树突状细胞体外表型。小鼠骨髓来源的树突状细胞在添加了细胞因子 rmGM-CSF(20 ng/mL)和 rmIL-4(10 ng/mL)的R10培养基中孵育。第 5天,加入 rmTNF-alpha(10 ng/mL),第 7天,收获树突状细胞,染色,流式细胞仪分析 图 2 Tetramer实验检测Asp f16多肽特异性 T细胞。Asp f16多肽特异性CD8+T细胞 (1×106/mL)与 Asp f16特异性 tetramer,APC荧光标记的抗鼠 CD8a单克隆抗体 4℃染色 30 min,然后进行流式细胞仪分析 图 3 ELISPOT实验检测 CD8+CTL特异性 IFN-γ的释放。5×103树突状细胞与 25μg/mL Asp f16多肽混合物或者对照肽37℃孵育 2 h,然后与 5×104同源的CTL共孵育 20 h。使用PHA作为阳性对照,每一个柱状图代表 3次实验的标准值 ±SD。A-PHA刺激 Asp f16多肽特异性 CTL;B-Asp f16多肽特异性 CTL;C-Asp f16多肽负载的树突状细胞活化Asp f16多肽特异性CTL;D-对照肽负载的树突状细胞活化对照肽特异性CTL;E-无多肽负载的树突状细胞活化 Asp f16多肽特异性 CTL;F-无多肽负载的树突状细胞活化对照肽特异性CTLFig.1 Phenotypes of the in vitro generated murine dendritic cells derived from bone marrow.The DCswerecultured in the R10medium supplemented with rmGM-CSF(20 ng/mL)and rmIL-4(10 ng/mL).On day 5,rmTNF-alpha(10 ng/mL)was added in and the DCs were harvested and analyzed by flow cytometry on day 7 Fig.2 Tetramerbased detection of Asp f16 peptides-specific T cells.Asp f16 peptidespecific CD8+Tcells(1×106/mL)were stained with Asp f16-specific tetramers and APC-labeled anti-mouse CD8amonoclonal antibody at 4℃for 30 minites.The cells were then analyzed by flow cytometry Fig.3 Specific IFN-γrelease by in vitro-stimulated CD8+CTL measured by ELISPOT.Dendritic cells(5×103)were incubated with 25μg/mL of Asp f16 peptides mixtures or control peptide at 37℃for 2 hours and then co-cultured with 5×104 autologous CTLs in each well for 20 hours.PHA was used as positive control in all assays.Each value was represented as the mean±SD.A-PHA stimulated Asp f16 peptides specific CTLs;B-Asp f16 peptides specific CTLs alone;C-Asp f16 peptides loaded DCs plus Asp f16 peptides specific CTLs;D-Control peptide loaded DCs plus control peptide specific CTLs;E-Peptide unloaded DCs plus Asp f16 peptides specific CTLs;F-Peptide unloaded DCs plus control peptide specific T cells

流行病学研究表明 IA的发病人群构成主要是造血干细胞移植患者、移植物抗宿主病患者、实体器官移植患者、肿瘤化疗患者、HIV感染者等,这类患者常常伴有严重的 T细胞免疫功能缺陷[1-5]。国内外大量研究也表明 T细胞免疫在宿主清除烟曲霉感染中具有重要作用,研究者发现通过过继转移烟曲霉培养粗提物抗原活化的小鼠 T细胞,能显著增加后继静脉内给予烟曲霉孢子的小鼠的存活率,从而证实了烟曲霉特异性 T细胞具有免疫治疗作用[7,9-11]。因此,体外建立供体来源的烟曲霉特异性 T细胞克隆,在受体对 IA易感时期 (例如:HSCT后早期,预防及治疗 GVHD时),过继转移给受体,可以建立受体针对烟曲霉的特异性免疫反应能力,从而保护受体免于发病或者增强其对治疗的反应性,免疫治疗 IA具有重要意义和广阔的应用前景[12-14]。

但是,我们的前期工作结果显示烟曲霉孢子的免疫原性较差,获得的烟曲霉特异性分泌 IFN-γ的Th1细胞绝对值较低,与国内外的研究结果较一致[7,17]。目前的多数研究使用烟曲霉孢子、菌丝或者烟曲霉胞壁蛋白粗提物作为抗原,除了含有相关的特异性抗原外,还包括大量的非相关抗原成分,包括糖类、蛋白质、核酸甚至毒素[6,10-14,17]。它的主要缺点是抗原为混合物,纯度低,且免疫原性不强,不适合临床应用,甚至危及患者生命。因此,筛选和鉴定合适的烟曲霉抗原表位,成为提高过继免疫治疗 IA疗效的关键问题。

研究发现烟曲霉重组过敏原 Asp f16(编码基因crf1,GenBank entry AJ223327,Genomic locus Afu1g16190)可以引起显著的 T细胞免疫应答[18,19]。研究者使用 Asp f16抗原作为疫苗免疫小鼠,诱导保护性 T细胞应答,增加了小鼠对抗肺烟曲霉感染的能力和存活时间[20]。据此,本研究根据烟曲霉抗原 Asp f16的氨基酸全序列信息,利用生物信息学软件,以我国汉族人群常见的限制性位点 HLA-A＊0201为靶点筛选合成 3条 HLA-I限制的 9肽,诱导产生烟曲霉特异性的 CTL,并进行实验室鉴定[16]。筛选和鉴定已知氨基酸序列抗原的 T细胞表位通常采用全长序列范围内的基序预测法和肽段重叠法,本研究采用基序预测法通过生物信息学软件预测烟曲霉抗原表位,与肽段重叠法相比较,可节省大量人力物力,可以作为一个快速高效筛选合适抗原肽的工作平台。

本研究建立了转人基因 HLA-A＊0201小鼠 DC培养,诱导成熟,抗原递呈,以及 CTL体外扩增体系,为进一步在实验动物体内模拟了人体发病和免疫应答反应的过程,评估多肽特异性 CTL在免疫治疗 IA的作用和 CTL杀伤烟曲霉的机制研究奠定基础。选择转人基因 HLA-A＊0201小鼠作为研究对象,将合成的生物信息学预测得到的烟曲霉Asp f16抗原肽预先皮下免疫 HLA-A＊0201转基因小鼠,可以模拟体内免疫环境,获得的引流淋巴结来源的 T细胞,使免疫反应最大化和最优化[15]。通过已有的技术平台,体外负载成熟的树突状细胞,由其加工、递呈给 T细胞,在体外制备烟曲霉多肽特异性 CTL[7]。MHC-四聚体试验证实了生物信息学预测的抗原表位与 HLA-A＊0201分子具有很强的的结合能力。ELISPOT试验证实生物信息学预测的烟曲霉 Asp f16的抗原肽可以活化 T细胞,并释放大量 IFN-γ。因此,本研究通过生物信息学预测的 3个抗原肽,经实验室鉴定为烟曲霉抗原Asp f16的 HLA-A＊0201限制性 CD8+CTL的抗原表位,可作为今后设计抗烟曲霉多表位肽疫苗的备选肽,并为进一步研究 CTL杀伤烟曲霉机制和免疫治疗 IA提供参考。

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