成纤维细胞激活蛋白对卵巢癌细胞增殖、迁徙和侵袭的影响

温秋婷 孙玉荣 李春红 刘鸿宇 柏青杨

1齐齐哈尔医学院病理学系，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2哈尔滨医科大学病理学教研室，黑龙江 哈尔滨 150081

成纤维细胞激活蛋白对卵巢癌细胞增殖、迁徙和侵袭的影响

温秋婷1孙玉荣1李春红2刘鸿宇2柏青杨1

1齐齐哈尔医学院病理学系，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2哈尔滨医科大学病理学教研室，黑龙江 哈尔滨 150081

背景与目的：肿瘤间质活化的成纤维细胞能表达成纤维细胞激活蛋白(fibroblast activation protein，FAP)，本研究通过体外实验研究FAP在卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁徙过程中的作用。方法：人类卵巢癌细胞系HO-8910PM体外培养，加入不同浓度的FAP(30、100和300 pmol/L)处理，用MTT法检测FAP对HO-8910PM增殖的影响；细胞划痕实验检测FAP对HO-8910PM迁徙能力的影响；Transwell侵袭实验来研究FAP对HO-8910PM侵袭能力的影响。结果：MTT法及细胞生长曲线显示FAP对卵巢癌细胞有促增殖作用，并呈时间、剂量依赖性；细胞划痕试验结果显示，不同浓度的FAP对卵巢癌细胞系的迁徙均有促进作用，以100 pmol/L组最为明显(P＜0.01)；Transwell侵袭实验显示FAP对卵巢癌细胞有促侵袭作用，以100 pmol/L组最为明显(P＜0.01)。结论：FAP具有促进卵巢癌细胞的增殖、迁徙和侵袭的作用。

成纤维细胞激活蛋白； 肿瘤转移； 卵巢癌细胞系HO-8910PM

卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，卵巢癌浸润、转移是造成卵巢癌死亡率高的主要原因，因此对其浸润和转移机制研究已成为热点。越来越多的研究证实，肿瘤的生物学特性不仅由癌基因和抑癌基因来调控，还依赖于间质形成的微环境作用。肿瘤细胞通过诱导基质(尤其是成纤维细胞)的活化，使成纤维细胞表达一些蛋白酶来参与侵袭和转移过程［1］，肿瘤间质中的成纤维细胞能表达多种蛋白酶，包括成纤维细胞激活蛋白(fibroblast activation protein，FAP)，尽管一些恶性肿瘤细胞也能产生蛋白酶，但主要还是由宿主的间质产生［2］。

FAP属Ⅱ型膜结合型糖蛋白，是脯氨酰基特异的丝氨酸寡肽酶家族(prolyl peptidase)成员之一，能专一性水解多肽中脯氨酸残基的氨基端肽键，具有二肽基肽酶和胶原酶的活性［1］。FAP在正常人组织中一般无表达，仅选择性表达于肿瘤微环境、愈合的创面及器官的生理性重建等［3-5］。因此，FAP在肿瘤相关成纤维细胞上的表达对形成促进肿瘤生长的微环境十分重要。

1 材料和方法

1.1 材料

高转移性卵巢癌细胞系HO-8910PM购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，用含10%小牛血清(香港耐肯博国际生物有限公司)的RPMI-1640培养基(美国Thermo公司)培养。FAPα纯化蛋白购自中国台湾Abnova公司，基质胶购自美国BD Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 卵巢癌细胞系HO8910-PM的培养和传代

冻存细胞复苏后用完全培养基RPMI-1640将细胞接种密度调整为4×105～5×105mL-1，于37 ℃，CO2体积分数为5%的细胞培养箱中培养，次日更换1次培养液。取生长状态达到平台期的细胞进行下面的实验。

1.2.2 MTT比色法测增殖实验

将HO8910PM接种(4.0×104mL-1)于96孔组织培养板中培养12 h，含有5% FBS的培养基。换成含有0.1% FBS的培养基，细胞用不同剂量的FAP α (0、100或300 pmol/L)处理，处理后的72 h内，每隔12 h各孔中分别加入20 μL新鲜配制的MTT溶液，37 ℃温育3 h。小心吸去孔内培养液，各孔加入150 μL DMSO，轻轻摇匀使结晶物充分溶解，在D490nm处读取各孔的吸光值。

1.2.3 Wound Healing法测迁徙实验

将HO8910PM接种(5.0×105mL-1)于12孔板中培养12 h细胞单层铺满。用无菌的200 μL枪头在单层细胞上划痕，划痕面积大约10 mm×1 mm。各孔加入含有0.1% FBS的培养基，细胞分别用0、30、100和300 pmol/L的FAPα处理，由于肿瘤细胞具有迁徙能力，随着时间的延续划痕会逐渐愈合，用FAPα处理12、24、36和48 h后在倒置荧光显微镜下观察并拍照，并用Image Pro Plus软件计算划痕愈合的面积。

1.2.4 Transwell小室法测侵袭实验

用Transwell小室法研究肿瘤细胞的侵袭能力。将50 μL Matrigel基质胶均匀涂布于Transwell小室的上表面，常规胰酶消化收集HO-8910PM细胞，清洗离心(1 500 r/min，离心半径5.8 cm，5min)后悬浮于含0.1%BSA的无血清培养基中，并计数1.1×106mL-1，每个Transwell小室内均匀滴加170 μL，各小室分别加入FAPα 0、30、100和300 pmol/L，下室加含有10% FBS的PRMI-1640培养基。48 h后用棉签擦去上室内没有侵袭过去的细胞，取下小室膜进行HE染色，在显微镜下随机选取10个高倍视野计数每个膜侵袭过来的细胞数量。

2 结 果

2.1 FAPα对 HO-8910PM增殖的影响

为了验证FAPα对HO-8910PM增殖能力的影响，用FAPα 100和300 pmol/L 2个浓度在不同的时间点进行增殖试验。结果在体外加入不同浓度的FAPα，对卵巢癌细胞系HO-8910PM均有促增殖作用，并呈剂量依赖性(图1)。FAPα促进HO-8910PM增殖的能力呈时间依赖性和剂量依赖性，在处理后48 h之内作用最明显(图2)。

2.2 FAPα对 HO-8910PM迁徙的影响

划痕实验检测FAPα对HO-8910PM迁徙能力。实验结果表明，用FAPα处理后HO-8910PM细胞的迁徙能力明显增强，在体外加入不同浓度FAPα的情况下，随着时间的推移，并不是药物浓度越大，癌细胞迁移速度越快，而是以100 pmol/L组引起的迁移效应最为明显，30 pmol/L组和300 pmol/L组次之。FAPα处理后48 h FAPα100 pmol/L组的划痕已经基本愈合。

2.3 FAPα对 HO-8910PM侵袭的影响

为了检测FAPα是否能增加HO-8910PM的侵袭能力，常规接种处于指数生长期，状态良好的卵巢癌细胞HO-8910PM于Transwell上室，分别加入不同剂量的FAPα使其终浓度为0、30、100和300 pmol/L，进行Transwell侵袭实验。结果发现，FAPα增强HO-8910PM的侵袭能力，以终浓度100 pmol/L作用最强(图4、5)。

3 讨 论

卵巢癌的浸润和转移是造成卵巢癌治疗困难死亡率高的主要原因。越来越多的研究证实肿瘤的发生、发展不是由上皮或间质单方面作用所决定的，而是由两者相互作用所形成的肿瘤-宿主界面微环境的平衡状态来决定，活化的成纤维细胞即肿瘤相关成纤维细胞(tumor associated fibroblasts，TAF)是肿瘤间质的主要成分，对肿瘤的发生、发展起着关键作用［6-9］。

大量的研究都倾向于癌细胞和间质成纤维细胞通过彼此相互作用而影响细胞的生长、分化、侵袭和相互调控［10］。如结肠癌细胞可以通过释放转化生长因子β(TGF-β)诱导临近间质的成纤维细胞。成纤维细胞活化以后，通过分泌大量的细胞外基质成分，如各种生长因子、胶原、蛋白酶和相应的抑制物反过来成倍地影响癌细胞本身［11］，这些变化诱导癌细胞发生侵袭前的生长行为［12-13］。肿瘤间质的成纤维细胞表达多种蛋白酶，能分泌多种基质酶如FAP，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)等，参与基质的降解和癌周间质的重建，因而与肿瘤细胞的浸润和转移有密切关系。

FAP是活化的成纤维细胞的标志性产物之一，是一种跨膜丝氨酸蛋白酶，具有二肽酶和胶原酶的双重活性，可以水解基质中二肽酶的许多底物、明胶以及Ⅰ型胶原，降解ECM，从而有利于肿瘤细胞从原发部位脱离、侵袭和远距离转移。通过降解ECM为内皮细胞的增殖和移动创造条件，与肌成纤维细胞共同参与ECM重建，促进肿瘤微血管网的形成，对肿瘤的浸润、转移及逆转具有重要意义［14］。本研究结果显示，FAPα能增加HO-8910PM的增殖、侵袭和迁移。

研究FAP在良恶性黑色素细胞瘤中表达发现，受检的所有黑色素瘤和细胞痣活化基质都可检测到FAP(+)成纤维细胞，并且在原发性和转移性黑色素瘤的活化基质中可检测到FAP的表达上调，这表明FAP对肿瘤细胞的生长和增殖可能具有调控作用［15］。另外临床研究也表明，肿瘤间质中FAPα高表达的结肠癌患者更容易出现病灶的转移及复发［16］。在肿瘤的侵袭及转移过程伴随着FAPα的高表达，说明

FAP在肿瘤的侵袭及转移过程中发挥重要的促进作用，其作用机制尚在研究中。目前科学界相对普遍接受的观点是：FAPα和膜结合的信号传导分子协同作用，利用FAPα的蛋白酶活性对信号分子或其他相关因子(例如肽类生长因子、趋化因子等)进行化学修饰，调节与肿瘤生长相关的兴奋性信号的传导。综上所述，FAP在肿瘤的发生、发展及转移中发挥着重要作用；基于FAPα可作为一种抗肿瘤靶分子，靶位丰富，局部浓度高且无个体差异性，能够针对绝大多数实体肿瘤发挥疗效，国外许多研究机构正在努力探究以FAPα为靶标的肿瘤靶向治疗的策略，并已取得一定成果，国内相关研究也开始起步。

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Biological effect of fi broblast activation protein (FAP) in the proliferation, migration and invasion of ovarian cancer

WEN Qiu-ting, SUN Yu-rong, LI Chun-hong, LIU Hong-yu, BAI Qing-yang(Department of Pathology, Qiqihar Medical University, Qiqihar Heilongjiang 161006,China)

BAI Qing-yang E-mail：blbqy7@sohu.com

Background and purpose：Activated fi broblasts of tumor stroma can express fi broblast activation protein (FAP). The purpose of this research was to study the effect of FAP in the proliferation, migration and invasion of ovarian cancer cellsin vitro.Methods：Human ovarian cancer cell line HO-8910PM was culturedin vitroand was treated with different concentrations of FAP(30, 100 and 300 pmol/L), then examined the function of FAP in the proliferation, migration and invasion of HO-8910PM by the colorimetric MTT Assay, Wound-Healing Assay and Transwell Assay.Results：Colorimetric MTT Assay and the curve of reproduction of cells showed that FAPα could increase HO-8910PM cell proliferation in a duration- and dose-dependent manner; Wound-Healing Assay conf i rmed that FAPα could promote the migration of the ovarian cancer cells, especially the function of 100 pmol/L group (P＜0.01);Transwell Assay certified that FAPα could promote the invasion of the ovarian cancer cells, especially the function of 100 pmol/L group (P＜0.01).Conclusion：FAP may induce the ovarian cancer cells proliferation, invasion and migration.

Fibroblast activation protein; Tumor metastasis; Ovarian cancer cell line HO-8910PM

10.3969/j.issn.1007-3969.2011.06.004

R737.31

A

1007-3639(2011)06-0441-05

柏青杨 E-mail:blbqy7@sohu.com

2011-03-15

2011-05-30）