Cyclin G1在下咽鳞癌中的表达及其临床意义

陈万军

山东省肿瘤医院头颈科，山东省医学科学院，山东 济南 250117

Cyclin G1在下咽鳞癌中的表达及其临床意义

陈万军

山东省肿瘤医院头颈科，山东省医学科学院，山东 济南 250117

背景与目的：细胞周期蛋白(Cyclin G1)可能参与多种恶性肿瘤的侵袭和转移，但鲜见Cyclin G1与下咽鳞癌关系的报道。本研究旨在探讨Cyclin G1在下咽鳞癌中的表达及其与临床生物学行为之间的关系。方法：取下咽鳞状细胞癌手术标本56例，正常黏膜标本14例，应用免疫组化方法检测Cyclin G1在下咽癌组织和正常黏膜中的表达；应用实时荧光定量RT-PCR检测Cyclin G1 mRNA表达。结果：免疫组化结果显示：Cyclin G1在下咽癌中表达主要位于细胞核，阳性率为53.6%(30/56)，而正常黏膜未见表达(P＜0.01)；随着肿瘤的增大，其阳性表达率逐渐增高(P＞0.05)；Cyclin G1在颈部淋巴结转移组阳性率为64.9%(24/37)，明显高于未转移组31.6%(6/19)(P＜0.05)；Cyclin G1阳性表达患者3年内复发率为60.0%，阴性表达患者3年内复发率 30.8%(P＜0.05)；Cyclin G1阳性表达患者5年生存率为30.0%，明显低于阴性表达患者5年生存率57.7%(P＜0.05)。RT-PCR检测Cyclin G1 mRNA在下咽癌组织中的相对表达量(1.081±0.302)高于正常黏膜组相对表达量(0.713±0.158)(P＜0.05)；中晚期原发肿瘤、颈淋巴结转移及远处转移患者Cyclin G1 mRNA表达量均略高于早期肿瘤、无颈淋巴结及远处转移患者(P＞0.05)，Cyclin G1 mRNA表达量越高肿瘤越容易复发(P＜0.05)，患者生存时间也越短(P＜0.01)，与免疫组化结果一致。结论：Cyclin G1在下咽鳞癌中存在高表达，其异常表达在下咽鳞癌的发生、发展中发挥着重要作用，可能是下咽鳞癌预后不良的指标之一。

CyclinG1； 下咽； 鳞状细胞； 癌

下咽鳞状细胞癌位置隐蔽，恶性程度高，是上消化道最致命的肿瘤，其诊断、治疗和预后的判断主要依据病变部位、临床分期及病理类型进行。然而不同患者存在个体差异，单靠这些标准往往不能得到个体化治疗，且对预后估计不足。目前，下咽鳞癌的发病机制不明，从细胞周期调控异常与肿瘤的关系来看，癌症很可能就是一类细胞周期疾病［1］。下咽癌被认为是一种多基因多步骤的复杂的细胞周期疾病，在癌变不同阶段有不同的细胞周期相关蛋白发生改变，包含多个基因突变的分子事件过程［2-3］。细胞周期的调节机制决定了细胞周期蛋白在肿瘤形成和发展中的重要作用，Cyclin G1是较晚发现的一种细胞周期蛋白，本研究通过观察下咽癌组织中Cyclin G1蛋白及基因的表达，研究其在肿瘤发生发展中的意义。

1 资料和方法

1.1 标本来源及治疗方案

56例标本均来自我院2003年1月—2005年12月临床病理资料保存完整的住院下咽鳞癌患者，男性54例，女性2例，年龄39～74岁，中位年龄56岁。病变位置：梨状窝48例，下咽后壁6例，环后区2例。术前未行任何治疗，均行手术切除，术后辅助放疗，剂量约为60 Gy。临床分期标准参照2002年国际抗癌学会(UICC)TNM标准，其中T12例，T29例，T320例，T425例；N019例，N115例，N220例，N32例；M055例，M11例(患侧腋窝转移，同期清扫)。

1.2 随访及对照设置

随访截止时间2010年12月，随访时间均在5年以上。另取下咽部正常黏膜组织14例(取自全喉切除术中最远的正常切缘，距离肿瘤边界3 cm以上)设为对照，所取组织经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，4μm连续切片，经HE染色证实为正常黏膜。

1.3 主要试剂

Cyclin G1鼠抗人单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发公司；Takara RNA PCR Kit(Amv)Ver3.0购自大连金生物有限公司，TRIzol 购自Invitrogen公司。

1.4 方法

1.4.1 免疫组化实验步骤 所有标本均经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，4μm连续切片，其中1张HE染色，其余切片进行免疫组化染色。全部玻片采用防脱片处理，免疫组织化学技术采用SP法，并行微波抗原修复。

1.4.2 RT-PCR检测目的基因mRNA表达的实验步骤 ⑴总RNA提取 取约100 mg 组织，加入1 mL TRIzol试剂，以高速匀浆机制备组织匀浆，匀浆转入1.5 mL Eppendorf 管中。4 ℃，12 000×g离心15 min，将上清液转入另一1.5 mL Eppendorf管中，每管加入 0.2 mL氯仿，涡旋振荡15 s混匀。室温5 min，4 ℃，12 000×g15 min，液体分为3层，将最上层水相轻轻转入另一1.5 mL Eeppendorf管中。每管加入0.5 mL异丙醇，颠倒混匀，室温温育10 min，4 ℃，12 000×g离心10min，可见管底有乳白色沉淀。弃上清液，每管加入用无RNase水配制的75%乙醇1 mL，4 ℃，7 000×g离心5 min。弃上清液，倒置离心管，室温凉干10 min。每管加入适量的无RNase水，并使RNA充分溶解。以 Eppendorf Biophotometer RNA模式测定RNA浓度及纯度，并将RNA浓度均调整为约500 μg/mL，备存用于RT-PCR反应。⑵两步法RT-PCR 反应。①反转录反应 反应体系如下：MgCl24 μL，10×RT 缓冲液 2.0 μL，RNase Free H2O 8.5 μL，dNTP Mixture(各10 mmol/L)2.0 μL，RNase 抑制剂0.5 μL，AMV 反转录酶 1.0 μL，9 mers 随机引物 1.0 μL，总RNA (≤1 μg) 1.0 μL，总体积20 μL。按下列程序逆转录：30 ℃预变性10 min，42℃变性30 min，95 ℃退火5 min，5 ℃延伸5 min。逆转录产物可以直接用于PCR反应，也可以-20 ℃保存备用。②PCR反应PCR反应体系：5×PCR 缓冲液 4 μL，灭菌蒸馏水10.8 μL，Taq酶0.1 μL，目的基因上游引物(10 μmol/L) 0.4 μL，目的基因下游引物(10 μmol/L)0.4 μL，内参照(GAPDH)上游引物(10 μmol/L) 0.2 μL，内参照(GAPDH)下游引物(10 μmol/L) 0.2 μL，样品的RT产物4 μL，PCR反应体系总体积为20 μL。以GAPDH为内参。两对内参引物序列如下：GAPDH-1-正义链：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，GAPDH-1-反义链：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’，GAPDH-1 的扩增长度为226 bp；GAPDH-2-正义链：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，GAPDH-2-反义链：5’-CTTCTGGGTGGCAGTGAT-3’，GAPDH-2的扩增长度为554 bp。⑶引物序列 Cyclin G1-正义链：5’-TGG CAACTGACTTGATCCG-3’，Cyclin G1-反义链：5-TCTGTGCTTGGATCTCTAATGC-3’。⑷PCR反应条件 94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s、52.5 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s、35个循环，72 ℃终延伸5 min。⑸琼脂糖凝胶电泳 Alpha Innotech Imager观察电泳条带存入图像，所用的DNA相对分子质量标记为DL2000。以系统软件的Spot Density功能分别半定量分析内参照和目的基因扩增条带的灰度，以目的基因条带的灰度与内参照管家基因的灰度比值代表基因表达的相对水平。

1.5 免疫组化诊断标准

以细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性，如细胞质和细胞核中同时出现棕黄色亦为阳性。以高倍镜视野中阳性细胞占计数同类细胞的百分数作为计数点，任取10个高倍视野，计算其平均值，根据阳性细胞率进行评分，阳性细胞率＜15%为0分；阳性细胞率15%～＜25%为1分；阳性细胞率25%～＜50%为2分；阳性细胞率＞51%为3分。同时根据细胞核染色强度加以评分，细胞核无着色为0分；浅黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。根据阳性细胞率与着色强度的乘积进行最后评分，0分为阴性，≥1分为阳性。以福建迈新生物技术开发公司提供的阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.6 统计学处理

免疫组化结果采用SPSS11.0软件包作χ2检验，RT-PCR结果进行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 免疫组化结果

56例组织中30例阳性表达，棕黄色颗粒主要位于细胞核(图1)，阳性率53.6%(30/56)，其中梨状窝25例阳性表达(52.1%，25/48)，下咽后壁区4例阳性表达(66.7%，4/6)，环后区1例阳性表达(50.0%，1/2)。T1未见阳性表达；T23例阳性表达(33.3%，3/9)；T311例阳性表达(55.0%，11/20)；T416例阳性表达(64.0%，16/25)。N06例阳性表达(31.6%，6/19)；N18例阳性表达(53.3%，8/15)；N214例阳性表达(70.0%，14/20)；N32例阳性表达(100.0%，2/2)。M029例阳性表达(52.7%，29/55)；M11例阳性表达(100.0%，1/1)。阳性表达患者3年内复发18例(60.0%，18/30)，阴性表达患者3年内复发8例(30.8%，8/26)；阳性表达患者5年生存率为30.0%(9/30)，阴性表达患者5年生存率为57.7%(15/26)。14例对照的正常黏膜均未见阳性表达(表1)。

表 1 Cyclin G1在下咽鳞中的表达Tab. 1 Expression of Cyclin G1 in hypopharyngeal squamous cell carcinoma.

2.2 RT-PCR检测结果

Cyclin G1 的扩增长度为296 bp，内参为GAPDH-2， 扩增长度为554 bp(图2)。结果表明, Cyclin G1 mRNA在下咽癌组织中的相对表达量(1.081±0.302)与正常黏膜组相对表达量(0.713±0.158)相比，差异有统计学意义(t=3.061，P=0.014)，说明CyclinG1 mRNA在下咽癌中的表达比正常黏膜高。中晚期原发肿瘤、颈淋巴结转移及远处转移患者Cyclin G1 mRNA表达量均略高于早期肿瘤、无颈淋巴结及远处转移患者，但差异均无统计学意义(P＞0.05)；Cyclin G1 mRNA表达量越高肿瘤越容易复发(P＜0.05)，患者生存时间也越短(P＜0.01，表2)。

表 2 Cyclin G1 mRNA在下咽鳞癌中的含量与临床病理参数及预后的关系Tab. 2 Relationship between Cyclin G1 mRNA expression in hypopharyngeal squamous cell carcinoma and clinicopathological features(±s)

表 2 Cyclin G1 mRNA在下咽鳞癌中的含量与临床病理参数及预后的关系Tab. 2 Relationship between Cyclin G1 mRNA expression in hypopharyngeal squamous cell carcinoma and clinicopathological features(±s)

Clinical pathologic data Cases Cyclin G1mRNA tP Cancer and normal 3.061 0.014 Cancer 56 1.081±0.302 Normal adjacent epithelium 14 0.713±0.158 Primary tumor 1.246 0.218 T1-2 11 1.010±0.354 T3-4 45 1.131±0.273 Lymph node metastasis 1.534 0.131 N0 19 1.025±0.298 N+ 37 1.149±0.282 Distant metastasis 0.043 0.967 M0 55 1.107±0.294 M1 1 1.120 3-year recurrence 2.459 0.017 Yes 26 1.206±0.259 No 30 1.022±0.294 Survival time/year 3.418 0.001＜5 32 1.213±0.304≥5 24 0.967±0.206

3 讨 论

Cyclin G是新发现的与传统周期蛋白不同的周期蛋白家族，包括3个亚型：Cyclin G1、Cyclin G2和Cyclin G3，它们在细胞周期调节、生长抑制、细胞凋亡和分化方面有特殊作用。Cyclin G1发现最早，其启动子内包括2个p53的结合位点，其因各种DNA损伤因子引起的表达上调与p53的激活相符。因此，Cyclin G1基因的表达与p53肿瘤抑制基因有着密切的关系，Cyclin G1已被证实是p53的一个下游基因，能被p53 诱导表达，在DNA损伤的修复和肿瘤发生中有重要作用。Cyclin G1通过PP2A调节MDM2的去磷酸化水平和部位进而调节p53而达到调节细胞生长的作用［4］。然而，Cyclin G1又经常在缺少p53的细胞和组织里被发现，故也可能通过独立于p53的途径被调节。Cyclin G1在胃腺癌组织中的阳性表达率为62.96%，其表达与肿瘤的分化程度相关，与肿瘤的浸润深度及有无淋巴结转移无关，Cyclin G1阳性表达在胃癌的发生、发展过程中起着重要作用，并可能以不依赖p53的途径发挥作用［5］。Cyclin G1蛋白主要定位于细胞核，在细胞周期各时相表达水平基本一致，较为稳定［6］。在结肠癌中，Cyclin G1的表达远高于正常组织，D期患者高于AB期患者，提示肿瘤侵袭的程度和范围可能与Cyclin G1的表达有关，但淋巴结转移与Cyclin G1的表达无显著相关［7］。Cyclin G1蛋白在卵巢浆液性囊腺癌中表达增高，可能与卵巢浆液性囊腺癌的发生、发展密切相关。研究表明Cyclin G1可能与细胞周期G2/M检查点的调控有关，在卵巢癌化疗中，Cyclin G1过表达的细胞对顺铂、多柔比星等药物的细胞毒性更加敏感，可用于卵巢癌化疗药物筛选［8］。最近的研究表明，Cyclin G1过表达可提高新生心肌细胞DNA合成，但抑制胞质分裂，导致双倍体、多倍体数目增加，Cyclin G1缺乏可延缓因负荷过大引起的多核心肌细胞的增加［9］。

总之，Cyclin G1在下咽鳞癌的发生、发展中有重要意义，Cyclin G1高表达及其mRNA高水平可能是下咽鳞癌预后不良的指标之一［10］。对于Cyclin G1高表达及其mRNA高水平患者，应加强综合治疗，密切随访。

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The clinical significance of Cyclin G1 in hypopharyngeal carcinoma

CHEN Wan-jun(Department of Head and Neck Surgery,Shandong Cancer Hospital,Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan Shandong 250117, China)

CHEN Wan-jun E-mail：wjchen2003@yahoo.com.cn

Background and purpose：Cyclin G1 may be involved in the progression of invasion and metastasis of many malignant tumors, but there have been few reports about the relationship between Cyclin G1 and hypopharyngeal carcinoma. This study aimed to determine the relationship between Cyclin G1 and the biological behavior of hypopharyngeal squamous cell carcinoma.Methods：Immunohistochemistry and real time quantitative polymerase chain reaction methods were applied to determine Cyclin G1 expression and gene amplification in 56 cases of hypopharyngeal squamous cell carcinoma and 14 cases of normal adjacent epithelium. The results were compared with clinical variables and patient outcomes.Results：Positive expressions of Cyclin G1 in the tumorous cell were observed in 30 cases (53.6%), whereas no expression of Cyclin G1 was found in normal epithelium(P＜0.01).Cyclin G1 overexpression increased gradually from T1 to T4, but no significant difference was found(P＞0.05). Cyclin G1 immunoreactivity in cases with lymph node metastases was significantly higher than those without lymph node metastases(P＜0.05). The recurrence rates in the patients with positive expression of Cyclin G1 were 60.0%, significantly higher than the patients with negative expression(P＜0.05). On the other hand, the 5-year overall survival rates for the patients with positive expression were 30.0%, significantly lower than that with negative expression(P＜0.05).The average Cyclin G1 mRNA level in patients with hypopharyngeal carcinoma were much higher than those in normal epithelium(P＜0.05). No significant difference of Cyclin G1 mRNA expression in primary tumor, lymph node metastasis and distant metastasis were found in hypopharyngeal carcinoma(P＞0.05). Cyclin G1 mRNA expression were significantly related with recurrence and survival time(P＜0.05).Conclusion：Cyclin G1 is highly expressed in hypopharyngeal squamous cell carcinoma. It may play a role in the progression of hypopharyngeal squamous cell carcinoma and can predict the probable course and outcome of the disease.

Cyclin G1; Hypopharynx; Squamous cell; Carcinoma

10.3969/j.issn.1007-3969.2011.02.008

R739.8；R730.23

A

1007-3639(2011)02-0120-05

山东省优秀中青年科学家科研奖励基金项目(No：2008BS03034)。

陈万军 E-mail:wjchen2003@yahoo.com.cn

2010-11-22

2011-01-10）