SPE-HPLC法测定大鼠血浆中的大黄素及药物动力学研究

徐会平， 冯素香，*， 李建生， 屈凌波，3， 李建军

（1.郑州大学，河南 郑州450001；2.河南中医学院，河南郑州450008；3.河南工业大学，河南郑州 450001）

SPE-HPLC法测定大鼠血浆中的大黄素及药物动力学研究

徐会平1， 冯素香1，2*， 李建生2， 屈凌波1，3， 李建军1

（1.郑州大学，河南 郑州450001；2.河南中医学院，河南郑州450008；3.河南工业大学，河南郑州 450001）

目的 建立大黄素在大鼠血浆中的固相萃取-高效液相色谱分析方法，研究大黄素在大鼠体内的药物动力学过程。方法 SD大鼠按高低剂量灌胃给药，用SPE-HPLC方法检测大黄素的血药浓度，DAS2.0软件计算药动学相关参数。结果 大黄素高低剂量的药时曲线均呈双峰现象，血药浓度随剂量增大有所增高，在体内分布广泛，但消除缓慢。结论

该方法对大黄素测定具有良好的准确度、精密度以及专属性，方法回收率在87.3% ～98.7%之间，大黄素在大鼠体内呈一室模型。

固相萃取；高效液相色谱法；大黄素；药物动力学

大黄是临床常用的重要中药，性寒、味苦，具有攻积导滞、泻火、凉血、活血祛瘀、利胆退黄等功效［1］。其主要成分为大黄蒽醌类衍生物如大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄酸、大黄素甲醚等。大黄素是中药大黄的有效成分之一，具有泻下、降脂、抑制血小板聚集、杀菌、止咳、解痉、降压等广泛的药理作用［2］。现代研究表明，大黄素等蒽醌类成分具有抗病原微生物、保肝利胆、影响胃肠道运动、抗癌等作用［3］。大黄苷元及其单体对脑缺血损伤后的炎性级联反应具有明显的阻抑作用，其保护肺损伤的作用与其拮抗炎性反应相关［4-5］。本实验采用固相萃取-高效液相色谱法，建立了大黄素血浆浓度的测定方法，为开展大黄素的药物动力学研究提供快速、准确、可靠的分析方法；并对其体内药动学过程行了分析，为进一步开展该药的药动学-药效学研究奠定了基础。

1 仪器和材料

1.1 动物 SD大鼠20只，雌雄各半，体质量为（280±20）g，河北省实验动物中心提供，合格证编号为1006120。

1.2 仪器 Waters高效液相色谱仪系统（Waters2695 Separations Module，Waters2996 Photodiode Array Detector Madein Singapore）；KQ-100型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TGL-16G台式离心机（上海安亭科学仪器厂制造）；Sarterius BS210S型电子天平；BY89-1型电动玻璃匀浆机（宁波新芝生物科技有限公司）；MDF-U32V型超低温冰箱（日本三洋株式会社）。

1.3 药品与试剂 大黄素、1，8-二羟基蒽醌对照品（购自中国药品生物制品检定所，批号分别为：110756-200910和0829-9702）；大黄素（自制，HPLC方法测定纯度为90%）；甲醇（色谱纯，Fisher公司）；乙腈（色谱纯，天津市四友精密化学品有限公司）；磷酸、三氯甲烷等试剂均为分析纯；娃哈哈水。

2 方法与结果

2.1 给药方式与样品处理

2.1.1 给药方式与取样 取健康的SD大鼠20只，随机分为2组。给药前禁食12 h，自由饮水。两组分别以50 mg/kg和20 mg/kg的剂量灌胃给药，大黄素用0.5%的羧羟基纤维素钠水溶液混悬。各大鼠于给药前和给药后0.083、0.167、0.250、0.333、0.500、0.667、0.833、1、1.25、1.5、2、2.5、3、4、6、10、12、24 h分别剪尾取血 0.5 mL。将不同时间采集的血样于肝素钠管中（内含1%的肝素钠0.5 μL，80℃烘干），3 000 r/min离心10 min，取上清液，于－80℃冰箱中冷冻，备用。

2.1.2 血样处理 分别取血浆200 μL于离心管中，加入内标 1，8-二羟基蒽醌溶液，使内标质量浓度为 0.1 μg/mL，加入4倍量的乙腈，涡旋振荡10 min，12 000 r/min离心20 min，上清液用4倍量的0.1%的磷酸水稀释，上活化好的3 mL的C18固相萃取小柱内（固相萃取小柱先用3 mL的甲醇活化，再用3 mL的水平衡），用5 mL 5%的甲醇水溶液除杂，再用2 mL乙腈洗脱，洗脱液于40℃水浴上，空气吹干，用100 μL 甲醇定容。

2.2 HPLC测定条件 色谱柱Venusil XBP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）（博纳艾杰尔科技有限公司）；流动相为甲醇-0.1%磷酸水（73∶27）；柱温25℃；检测波长254 nm；体积流量：1 mL/min；进样量20 μL；内标1，8-二羟基蒽醌。

2.3 系统适应性试验 在上述色谱条件下，大黄素与内标的色谱峰分离良好，且空白血浆对其无干扰峰。大黄素对照品加内标，空白血浆，空白血浆加对照品和内标，血浆样品加内标的色谱图见图1。

图1 大黄素对照品加内标（A）、空白血浆（B）、空白血浆加对照品和内标（C）、血浆样品加内标（D）的色谱图

1.1 ，8 -二羟基蒽醌 2.大黄素

2.4 标准曲线的制备 分别精确称取大黄素，1，8-二羟基蒽醌各2 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，分别配制成质量浓度为80 μg/mL的大黄素、内标贮备液。采取微量稀释法将大黄素和内标标准品母液加到空白血浆，使大黄素质量浓度分别为 0.02，0.04，0.06，0.08，0.1，0.2，0.4，0.6 μg/mL，且每一溶液中1，8-二羟基蒽醌的质量浓度均为0.1 μg/mL，按血样和组织处理项下方法处理后进样检测，以大黄素与内标的峰面积比值为纵坐标，大黄素血样质量浓度为横坐标，进行线性回归，回归方程分别为：Y=0.564 1X+0.030 1，R2=0.999 3；线性范围为：0.02 ～1.0 μg/mL，最低检测限为0.02 μg/mL。

2.5 方法回收率试验 将大黄素标准品母液加入到空白血浆中，配制成质量浓度为 0.02、0.1、0.6 μg/mL，1，8-二羟基蒽醌的质量浓度均为0.1 μg/mL的对照品血浆溶液各5份，按2.1.2项下方法处理后进样，根据大黄素回归方程计算药物浓度，与加入值进行比较，计算加样回收率，结果平均回收率分别为 87.3%（RSD=3.01%），94.6%（RSD=2.72%），98.7%（RSD=2.84%）。

2.6 精密度试验 同方法回收率试验项下配制对照品血浆溶液各5份，按2.1.2项下方法处理后进样，每日重复测定5次，计算日内精密度；连续测定5 d，计算日间精密度。结果见表1。

表1 日内及日间精密度（x ± s，n=5）

2.7 药动学试验 取健康的SD大鼠20只，按2.1.1项下给药取样，并按2.1.2项下方法处理各个时间点的血样并测定，平均血药浓度-时间曲线见图2，经DAS 2.0药动学软件计算出主要药动学参数见表2。

图2 大鼠灌胃不同剂量的大黄素血药浓度-时间曲线图

表2 大鼠高低剂量灌胃给予大黄素后的药物动力学参数（x ± s，n=10）

由图2和表2可知大黄素在大鼠体内的药动学呈一室模型，高、低剂量的药时曲线均呈双峰现象。高、低剂量的tmax1和 tmax2分别为 0.33 h、2.5 h 和 0.25 h、2 h，高、低剂量的Cmax1和 Cmax2分别为0.599 mg/L、0.421 mg/L 和0.295 mg/L、0.232 mg/L，高、低剂量的药代动力学参数具有显著性差异（P＜0.05）。血药浓度随剂量增大有所增高，表观分布容积V1/F也有所增大。

3 讨论

本实验以1，8-二羟基蒽醌为内标，采用SPE-HPLC法建立了血浆中大黄素的定量测定方法，并研究了其不同剂量的药物动力学。经方法学验证表明，该法灵敏度高，杂质干扰少，结果准确，可用于生物样品中大黄素的定量分析。

药动学研究结果表明，大黄素高低剂量的t1/2（4.566±0.254、6.659 ±0.314 h），清除率 CL/F（0.601 ±0.033、0.978±0.014 L/h/kg）均表明大黄素体内消除比较缓慢，表观分布容积 V1/F（194.97 ±16.767、421.06 ±18.984 L/kg）较大，提示大黄素体内分布广泛。大黄素各剂量的药时曲线均呈现双峰，与文献报道相符［6-7］，可能是因为大黄素在大鼠体内的药物动力学过程存在肠肝循环现象也可能是大黄素快速分布至其他脏器后再次吸收入血，形成第二个峰所致，尚需实验进一步证实。大黄素在大鼠体内入血较快，但血药浓度较低，本实验可为与大黄素结构相似的蒽醌类成分进一步体内代谢研究提供参考，有助于进一步阐明大黄药理作用的物质基础。

［1］郭望祥.大黄药理作用概述［J］.江汉大学学报：医学版，2002，30（2）：60.

［2］孙文基，绳全房主编.天然活性成分简明手册［M］.北京：中国医药科技出版社，1998：209.

［3］伍晓春，陆 豫.虎杖的药理作用及临床应用研究进展［J］.中医药信息，2005，2（2）：22.

［4］李建生，刘敬霞，方 建，等.大黄苷元抗大鼠脑缺血损伤及对炎性细胞因子的影响［J］.中国中西医结合急救杂志，2005，12（5）：275-278.

［5］李建生，刘敬霞，张伟宇，等.大黄素抗大鼠脑缺血损伤及对炎性因子反应的影响［J］.中国中药杂志，2005，30（24）：1939-1943.

［6］李兰芳，张勤增，解丽君，等.通脉活血灵胶囊中大黄素在大鼠血浆中的浓度及药代动力学研究［J］.河北医药，2006，28（11）：2020-2022.

［7］姚树坤，蒋 晔，赫晓花，等.虎杖及其复方中大黄素在大鼠体内的药代学研究［J］.中国中药杂志，2005，30（6）：463-465.

R969.1

B

1001-1528（2011）07-1230-03

2010-09-25

国家自然科学基金资助项目（30873265）；河南省高校青年骨干教师资助项目（2009GGJS-065）；郑州市科技攻关项目（0910SGYS33390-7）

徐会平（1985—），女，硕士生。E-mail：xuhuiping426@163.com

冯素香（1971—），女，博士生，副教授，从事中药质量控制与新药研究工作。Tel：（0371）65680562，E-mail：fengsx221@163.com