HPLC法同时测定银翘柴桂颗粒中绿原酸、芍药苷和黄芩苷

桂蜀华， 陈 军， 王 林， 鲍 涵， 左峻岭， 张 军， 赖小平， 林培政

（1.广州中医药大学，广东广州510006；2.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405）

HPLC法同时测定银翘柴桂颗粒中绿原酸、芍药苷和黄芩苷

桂蜀华1， 陈 军1， 王 林1， 鲍 涵1， 左峻岭2， 张 军1， 赖小平1， 林培政1

（1.广州中医药大学，广东广州510006；2.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405）

目的 为有效控制银翘柴桂颗粒（金银花，白芍，黄芩，重楼等）的质量，建立制剂中绿原酸、芍药苷和黄芩苷的HPLC定量测定方法。方法 色谱柱Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相 甲醇－0.1%磷酸梯度洗脱；检测波长绿原酸和黄芩苷327 nm、芍药苷230 nm；体积流量1.0 mL/min。结果 绿原酸、芍药苷和黄芩苷分别在0.068 88～0.688 8 μg、0.066 96 ～ 0.669 6 μg 和 0.121 6 ～ 1.216 μg 的范围内呈良好的线性关系，加样回收实验平均回收率103.70%、103.31%、97.92%。RSD为1.07%、2.07% 和1.32%。结论 此法操作简捷，结果准确可靠，精密度好，可用于银翘柴桂颗粒中绿原酸、芍药苷和黄芩苷的定量测定。

银翘柴桂颗粒；绿原酸；芍药苷；黄芩苷；HPLC

银翘柴桂颗粒主要由金银花、白芍、重楼等药材组成，有辛凉透表、清热解毒之功效，治疗甲型H1N1流感患者疗效确切，可明显缓解症状，缩短病程，逆转病情发展［1］。近年来甲型H1N1流感暴发并迅速在世界范围内流行，对人民群众的健康带来了极大的威胁，给社会造成了巨大的损失［2］。制剂中的金银花提取物具有抑菌和杀菌作用［3］，其绿原酸具抗病毒［4］、抗菌、免疫调节、清除氧自由基［5］等多种功效，白芍中的白芍总苷有抗炎镇痛等作用［6］，芍药苷具有抗炎和免疫抑制作用［7］，黄芩的黄酮类成分生物活性广泛［8］，黄芩苷解热镇痛作用明显［9］，此外还有抗自由基和保肝等作用［10］，为了方便控制其质量，本实验对以上3种成分进行了测定，确保患者服用药物的安全，有效稳定。

1 实验材料

1.1 仪器及试药 岛津LC-20A高效液相色谱仪，含SPD-20A检测器，LC-20AT泵，SIL-20A自动进样器，DGU-205脱气机，Lc solution工作站；Sartorius CP225D分析天平。

1.2 药品与试剂 甲醇为色谱纯（Merck公司），水为超纯水，其它试剂均为分析纯；对照品：绿原酸（110753-200413）、芍药苷（110736-200934）和黄芩苷（110715-200815）购于中国药品生物制品检定所；银翘柴桂颗粒批号（20100508、20100909、20100910）。

2 方法与结果

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

2.1 色谱条件 色谱柱Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相 甲醇 －0.1 磷酸按表1 梯度洗脱；检测波长 绿原酸和黄芩苷327 nm、芍药苷230 nm；体积流量1.0 mL/min；进样量10 μL。色谱图见图1。

表1 梯度洗脱顺序Tab.1 Gradient elution of mobile phase

2.2 对照品溶液制备 取绿原酸、芍药苷和黄芩苷对照品适量，精密称定，制成每1 mL含绿原酸30 μg、芍药苷 30 μg和黄芩苷 60 μg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液及阴性对照溶液的制备 取装量差异项下的本品，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率35 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；分别取缺金银花、白芍和黄芩阴性样品，同法制备阴性对照溶液。按上述色谱条件进行测定，结果表明绿原酸、芍药苷和黄芩苷峰分离度良好，阴性无干扰。

2.4 线性关系考察 精密吸取绿原酸、芍药苷和黄芩苷混合对照品溶液 2、4、8、16、20 μL，按 2.1 项下色谱条件分别进样测定，以进样质量（μg）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，绿原酸标准曲线为：Y=2 753 927.36X+613.42，r=1.000 0，在0.068 88 ～0.688 8 μg 范围内呈良好的线性关系；芍药苷标准曲线为Y=1 168 625.55X+2 318.57，r=1.000 0，在 0.066 96 ～0.669 6 μg 范围内呈良好的线性关系；黄芩苷标准曲线为Y=2 644 754.79X+8 979.27，r=1.000 0，在0.121 6 ～1.216μg范围内呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 精密吸取供试品溶液10 μL，重复进样6次，记录绿原酸、芍药苷和黄芩苷峰面积，计算其RSD 分别为0.13%、0.38%和0.29%。表明精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、16 h进样，测定绿原酸、芍药苷和黄芩苷的峰面积，计算 RSD 分别为0.76%、1.64%和1.37%，表明供试品溶液在16 h内稳定。

2.7 重复性实验 取同一批供试品6份，按2.3项下供试品溶液的制备方法处理，按2.1项下色谱条件分别进样10 μL进行测定，记录峰面积，计算绿原酸、芍药苷和黄芩苷质量分数的相对标准偏差，RSD分别为0.33%和1.23%和1.52%，结果表明本方法重现性好。

2.8 加样回收率测定 称取已测定的同一批银翘柴桂颗粒（20100508）药粉9份，每份0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入绿原酸对照品、芍药苷对照品和黄芩苷对照品适量，按供试品溶液制备方法制备，测得绿原酸、芍药苷和黄芩苷质量分数，计算绿原酸、芍药苷和黄芩苷平均回收率分别为103.7%、103.3%和 97.9%，RSD 分别为 1.07%、2.07%和1.32%，结果表明本方法回收率良好。见表2～表4。

表2 加样回收率试验结果（绿原酸）Tab.2 Results of recovery test（chlorogenic acid）

表3 加样回收率试验结果（芍药苷）Tab.3 Results of recovery test（paeoniflorin）

表4 加样回收率试验结果（黄芩苷）Tab.4 Results of recovery test（baicalin）

2.9 样品的测定 取3批银翘柴桂颗粒样品（20100508、20100509、20100510），照供试品溶液制备方法制备，精密吸取10 μL注入液相色谱仪，测定峰面积，计算绿原酸、芍药苷和黄芩苷质量分数，结果见表5。

表5 样品测定结果 （n=3）Tab.5 Determintion results of samples （n=3）

3 讨论

3.1 本实验考察了回流和超声提取，结果两种方法效果相近，因超声提取方法简便，确定超声提取。溶媒考察了甲醇、50%甲醇和70%乙醇［11］，结果70%乙醇对3种成分提取均较好。以70%乙醇为溶媒，提取时间考察了15、30、45 min，结果30 min时3种指标成分已基本提取完全，因此提取时间采用30 min。

3.2 为保证各指标成分得到良好分离，流动相考察了甲醇-水系统、甲醇－0.1%磷酸和甲醇－0.4%磷酸［12］，结果以甲醇－0.1%磷酸为流动相时各成分得到了良好分离；黄芩苷比较了280 nm和327 nm检测波长［13］，结果327 nm基线比280 nm平稳，所以优选327 nm。

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Determination of chlorogenic acid，paeoniflorin，and baicalin in Yinqiao Chaigui Granules by HPLC

GUI Shu-hua1， CHENG Jun1， WANG Ling1， BAO Han1， ZUO Jun-ling2， ZHANG Jun1， LAI Xiaoping1，LIN Pei-zheng1

（1.Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510006，China；2.The First Hospital Affiliated to Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510405，China）

AIMTo explore a method for simultaneously determining chlorogenic acid，paeoniflorin，and baicalin in Yinqiao Chaigui Granules（Lonicerae japonical Flos，Paeoniae Radix alba，Scutellariae Radix，Paridis Rhizoma，etc.）.METHODSThe Kromasil C18column（250 mm ×4.6 mm，5μm）was used with methanol-0.1%phosphoric acid as the mobile phase，the flow rate was 1.0 mL/min，the detection wavelength was set at 327 nm and 230 nm.RESULTSThe linear range of chlorogenic acid was 0.068 88-0.688 8 μg，and the average recovery was 103.70%，RSD was 1.07%.The linear range of paeoniflorin was 0.066 96-0.669 6 μg ，and the average recovery was 103.31%，RSD was 2.07%.The linear range of baicalin was 0.121 6-1.216 μg，and the average recovery was 97.92%，RSD was 1.32%.CONCLUSIONThe method is rapid，convenient，accurate，and can be used to control the quality of this preparation.

Yinqiao Chaigui Granules；chlorogenic acid；paeoniflorin；baicalin；HPLC

R927.2

A

1001-1528（2011）07-1175-04

2010-12-14

国家“十一五”支撑计划（BAI2006B0105）

桂蜀华（1972—），女，博士，副研究员，研究方向：中药新药研究与开发。Tel：13631396525，E-mail：gj1615@sohu.com