喉癌组织中内皮素1表达与淋巴管和血管生成的相关性研究

王 莹，李文媛，杨春壮，冯克俭

（牡丹江医学院解剖教研室，黑龙江牡丹江 157011）

内皮素（endothelin，ET）是一种具有多种生物学效应的活性肽。ET家族中与肿瘤关系最密切的是血管ET-1［1］，不仅产生于血管内皮细胞，也可由人体内多种肿瘤细胞所分泌，是近年来肿瘤防治研究的热点。有研究表明，在口腔癌、卵巢癌、甲状腺癌、皮肤癌、肺癌等［2-6］多种恶性肿瘤中可见ET-1有高表达，并与肿瘤的发生、发展有显著关系，但ET-1在喉癌中的作用尚未见相关报道。为此，该研究对喉癌中ET-1表达与淋巴管密度（lymphatic vessel density，LVD）、微血管密度（microvessel density，MVD）、淋巴结转移和喉癌预后的关系进行研究，旨在为喉癌的诊治研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 一般资料 取中国医科大学附属第一医院耳鼻喉科2004年1月至2009年3月首次手术治疗的原发喉癌患者，共计45例。男43例，女2例，患者年龄41～86 岁，中位年龄63.5岁。声门上癌17例，声门癌23例，声门下癌 5例。按1997年UICC的TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期31例。有颈部淋巴结转移者15例，淋巴管浸润者8例，所有病例均无远处转移，术前未接受化疗、放疗及其他抗癌治疗。生存资料通过信访或电话获得，生存期开始时间自手术日期始，至2009年6月1日止，其中2例失访。生存期计算以月为单位，未满整月以实际生存天数计算。随访期限为3～71个月，中位数为31个月。死亡病例均由复发或转移引起。同时收集10例正常喉良性病变用于对照。

1.2 主要试剂 二甲胂酸钠，腺苷-5'-磷酸钠，萘酚AS-MX磷酸钠，左旋咪唑，固蓝BB盐，二甲基甲酰胺（DMF）均购自美国 SIGMA公司。兔抗人 ET-1抗体、兔抗人CD34抗体、免疫组化SP试剂盒、DAB显色试剂盒购于北京中山生物试剂公司桥生物公司，抗β-actin抗体购于Santa Cruz公司。

1.3 免疫组织化学染色 石蜡切片常规脱蜡至水，0.5%过氧化氢孵育10 min;PBS漂洗3次，正常山羊血清37℃孵育15 min后，滴加稀释后的一抗ET-1（1∶100）、CD34（1∶100）。4℃过夜。滴加生物素标记体，30 min，37℃。滴加过氧化物-链霉素卵白素37℃，30 min。3，3-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）显色液显色，苏木精复染。以PBS代替一抗作阴性对照。镜下观察并摄片。阳性率的定量分析:随机选取5个高倍视野按阳性细胞比例及着色程度记分，行半定量分析。无着色细胞记为0分;着色细胞比例≤1/3记为1分;1/3＜着色细胞比例≤2/3记为2分;着色细胞比例＞2/3记为3分。浅黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分;然后根据二者乘积判断阳性结果:二项乘积≤3分记为（－）;＞3分记为（+）。MVD定量分析:采用 Weidner等［7］制订的方法确定微血管密度，先在低倍镜下选择淋巴管最丰富区域，在高倍镜下计数5个视野微血管数取其平均值作为微血管密度。

1.4 酶组化染色方法 冰冻切片吹干后，分两组:A组作5'-Nase染色，即将切片置入5'-Nase标准液（反应液）内，37℃孵育40 min。水洗后入1%硫化铵内2 min后封片，光镜下观察结果。反应液内含有0.2 mol/L的 Tris-顺丁稀二酸缓冲液（pH7.2）20 mL，腺苷5'-磷酸钠（5'-AMP）25 mg，硫酸镁123 mg，硝酸铅60 mg，蔗糖3 g，蒸馏水22 mL。B组作对照试验，将孵育液中的底物去除，即再反应液内不加腺苷5'-磷酸钠，其余步骤同A组。LVD定量分析:参照Kaiserling［8］计数方法，先在低倍镜下选择淋巴管最丰富区域，在高倍镜下计数5个视野淋巴管数，取其均值作为该切片淋巴管数。

1.5 Western blot检测 检测ET-1提取蛋白后采用BCA定量试剂盒测定蛋白浓度。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶电泳分离蛋白后转至硝酸纤维素膜;封闭缓冲液封闭后，加入一抗（anti-ET-1，1∶100稀释）4℃孵育过夜，二抗（1∶2000稀释）孵育2 h，TBS洗净后经显色液显示15 min，扫描后经ImageJ图像分析软件对印迹区进行灰度分析。

1.6 统计学方法 所得数据采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计数资料采用 χ2检验，两组间LVD、MVD比较采用t检验，Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存曲线差异性采用 Log-rank法检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 喉癌组织中ET-1的表达与临床病理参数的关系 ET-1阳性表达主要位于细胞质和细胞膜，呈棕黄色颗粒（图1A），阴性细胞胞质不着色。5'-Nase特异性地表达在喉癌组织中毛细淋巴管内皮细胞，标记毛细淋巴管呈棕色管腔（图1B），血管内皮细胞和肿瘤细胞未见表达。CD34染色后微血管内皮细胞胞质呈棕黄色，标记微血管呈棕色管腔（图1C）。ET-1在喉癌组织蛋白表达显著高于正常组织（χ2=7.084，P＜0.05）。在各种临床病理因素中，ET-1蛋白表达与淋巴管密度（t=38.633，P=0.042）、微血管密度（t=229.614，P=0.05）、TNM 病理分期（χ2=7.106，P=0.05）、淋巴结转移（χ2=7.679，P=0.05）和淋巴管浸润（χ2=7.784，P=0.05）密切相关，但与年龄、性别、肿瘤部位、组织学分级无关（χ2=3.375、2.616、2.492、2.510，P＞0.05）（表1，2）。

图1 A 喉癌组织中ET-1阳性表达（SP×200） 图1B 喉癌组织中淋巴管（5'-Nase×200） 图1C 喉癌组织中微血管（SP×200）

2.2 Western-blot检测喉癌组织中ET-1的表达Western-bolt检测6例喉癌组织和6例喉良性病变组织中ET-1蛋白表达，结果显示喉癌组织中ET-1蛋白的相对表达较正常喉组织显著增高（t=28.838，P＜0.05）（图 2）。

2.3 ET-1阳性表达与生存率的关系 按ET-1表达阴性和阳性将喉癌患者分为两组［（－）为阴性，（+）为阳性］，Kaplan-Meier生存分析绘出喉癌患者整体生存曲线，ET-1阳性表达平均生存时间为37个月，阴性表达组平均生存时间为55个月，Log-rank检验表明两组生存率无显著性差异（χ2=1.148，P＞0.05）（图3）。

图2 ET-1蛋白在喉癌与配对良性病变组织中的表达

图3 喉癌患者整体生存曲线

表1 喉癌组织中ET-1的表达与临床病理因素的关系

表2 喉癌组织中ET-1的表达与LVD、MVD的关系±s）

表2 喉癌组织中ET-1的表达与LVD、MVD的关系±s）

注:*与ET-1阴性组比较，P＜0.05

组别 例数 ET-1（+）（n=25） （－）（n=20）LVD 45 12.82 ±5.79 5.77 ±2.83 MVD 45 24.82 ±8.54 18.91 ±7.42 t 38.633 29.614 P 0.042* 0.009*

3 讨论

目前的研究发现，ET-1在多种人类恶性肿瘤发生、发展中发挥着重要作用，引起了国内外学者的重视，有研究表明其促肿瘤的作用机制可能包括以下几个方面:①通过细胞内一系列信息转导途径引起细胞有丝分裂和增殖［9］。②促进新生肿瘤血管形成［10］。③抑制肿瘤细胞凋亡［11］。④促进肿瘤转移与侵袭［12］。但ET-1是否在喉癌中发挥相同作用尚不清楚。本研究发现喉癌组织中ET-1蛋白表达显著增高，与TNM临床分期、淋巴结转移等病理因素密切相关，说明ET-1能够在喉癌的发生和发展中发挥重要作用。杨小燕等［13］认为肿瘤组织分化程度越高，ET-1表达越低，但该研究不支持此观点，该研究的结果显示，喉癌组织中ET-1表达与分化程度无关。

有研究证实，ET-1在卵巢癌、甲状腺癌及肺癌中具有促血管生成作用［3，4，6］。该研究发现喉癌组织中ET-1表达与MVD密切相关，说明ET-1能够促进喉癌组织中血管生成，从而增加喉癌侵袭和转移的机会。ET-1是否能够促进喉癌淋巴管生成，目前未见相关报道。本研究中喉癌组织中ET-1表达与LVD、淋巴管浸润和淋巴结转移密切相关，提示ET-1不仅可以促进喉癌血管生成，还可以促进喉癌淋巴管生成，加速喉癌细胞淋巴管浸润与淋巴结转移，其作用机制可能与ET-1表达增高能够上调淋巴管生长因子血管内皮生长因子C和血管内皮生长因子D的表达，进而促进淋巴管生成有关［14］。

目前ET-1对肿瘤预后的相关报道尚不多见，且争议较多。如Arun等［15］认为 ET-1、年龄与组织学分期可以影响大肠癌的预后，而Peeters等［16］发现，ET-1表达与大肠癌预后无关。Wulfing等［17］认为，ET-1的高表达与乳腺癌生存时间相关，但Yamashita等［18］发现，ET-1对乳腺癌生存时间并无影响。本试验通过Kaplan-Meier生存分析绘出45例喉癌患者整体生存曲线，结果表明ET-1阳性表达与生存曲线不相关。然而，因为此研究是针对一组有限喉癌患者数量的回顾性研究，所以ET-1与喉癌预后的关系仍有待于进一步大样本前瞻性的临床研究。

综上所述，ET-1不仅可以促进喉癌血管生成，也可以促进喉癌淋巴管生成和淋巴结转移。ET-1在肿瘤血管生成和淋巴管生成中的作用及基于此的肿瘤抗血管和淋巴管生成的靶向治疗将为人们开辟一条新的途径。

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