慢支咳喘膏的质量标准研究

陈瑶，肖芳，冯琳珊，肖鹏，董慧，刘祖祥，邹启发（.云南省第一人民医院药剂科，昆明市 650000；.云南白药集团股份有限公司技术质量部，昆明市 650000）

慢支咳喘膏是云南省第一人民医院临床使用40余年的协定处方，由麻黄、黄芪、甘草、南沙参等药材组成，具有益气补肺、止咳化痰、平喘的功效，主要用于治疗慢性支气管炎、肺气肿、肺心病等所致的久咳喘症，效果显著。本试验对制剂中麻黄、黄芪、甘草3味药材进行薄层色谱（TLC）鉴别，同时用高效液相色谱（HPLC）法测定了制剂中盐酸麻黄碱和盐酸伪盐酸麻黄碱的含量，旨在建立慢支咳喘膏质量控制的有效方法。

1 仪器与试药

Agilent1100型HPLC仪，包括G1315B紫外检测器、G1316A柱温箱、G1313A自动进样器、G1311A四元梯度泵、G1379A真空脱气机、Agilent ChemStation工作站（美国Agilent公司）；薄层层析用硅胶G板（青岛海洋化工有限公司，规格：100 mm×100 mm）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、黄芪甲苷、甘草酸铵对照品和甘草对照药材（中国药品生物制品检定所，批号分别为0090-9801、1237-200103、0781-200311、100731-200615、120904-2004101）；黄芪、麻黄、甘草饮片（批号分别为100401、100601、100401）、样品（批号：20100122、2010051820101025）及相应阴性样品均由昆明道地中药厂提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（97∶3）；流速：1 mL·min-1；检测波长：210 nm；柱温：30℃；进样量：10µL。理论板数按盐酸麻黄碱色谱峰计算应＞6000。

2.2 定性鉴别

2.2.1 麻黄的TLC鉴别 取本品20 g，加10%氨水试液30 mL，充分混匀，加氯仿提取2次，每次40 mL，合并氯仿液，蒸干。残渣加20%盐酸1 mL溶解，作为供试品溶液；另取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液；取缺麻黄的阴性样品2 g，同供试品制备方法制成阴性对照溶液。照TLC法[2]试验，吸取上述3种溶液各5～10µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-氨水（20∶3.5∶0.5）溶液为展开剂，展开8 cm，取出，晾干，喷以1%茚三酮溶液，加热至斑点清晰。结果，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同的红色斑点；阴性对照无干扰。麻黄的TLC见图1。

2.2.2 黄芪的TLC鉴别[1]取本品15 g，加甲醇40 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水30 mL，加热使溶解，用乙醚提取3次，每次15 mL，弃去乙醚液，水层挥去乙醚，用水饱和的正丁醇提取3次，每次20 mL。合并正丁醇液，用正丁醇饱和的1%KOH溶液洗涤3次，每次15 mL，再用正丁醇饱和的水洗涤至中性，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液；另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液；取缺黄芪的阴性样品3 g，同供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。照TLC法[2]试验，吸取上述3种溶液各5～10µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水（6∶3∶0.5）溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点清晰，置紫外光（365 nm）下检视。结果，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点；阴性对照无干扰。黄芪的TLC见图2。

2.2.3 甘草的TLC鉴别[2]取本品10 g，加乙醚50 mL，超声处理1 h，滤过，药渣加甲醇40 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗脱3次，每次20 mL，蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材2 g，同法制成对照药材溶液；再取甘草酸铵对照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。取缺甘草的阴性样品3 g，同供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。照TLC法[2]试验，吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（6∶1∶3）溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点清晰，置紫外光（365 nm）下检视。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的黄绿色荧光斑点；阴性对照无干扰。甘草的TLC见图3。

图1 麻黄的TLC1～3.供试品；4.盐酸麻黄碱对照品；5.阴性对照Fig 1 TLC of Herba Ephedrae1～3.test samples；4.ephedrinehydrochloridecontrol；5.negative control

图2 黄芪的TLC1～3.供试品；4.黄芪甲苷对照品；5.阴性对照Fig 2 TLC of Astragalus membranaceus1～3.test samples；4.astra-galosideⅣ c ontrol；5.negative control

图3 甘草的TLC1～3.供试品；4.甘草对照药材；5.甘草酸铵对照品；6.阴性对照Fig 3 TLC of Radix Glycyrrhizae1～3.test samples；4.Radix Glycyrrhizae reference substance；5.ammonium glycyrrhetate control；6.negative control

2.3 含量测定

2.3.1 混合对照品溶液的制备 精密称取盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加0.1 mol·L-1盐酸溶液制成每1 mL含盐酸麻黄碱10µg和每1 mL含盐酸伪麻黄碱30µg的溶液，即得。

2.3.2 供试品溶液的制备 取本品10 g，精密称定，加水10mL和浓氨试液 7 mL，用乙醚振摇提取5次（30、30、30、20、20 mL），合并乙醚液，低温回收至干，残渣用乙醇3mL溶解并转移至10 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1盐酸溶液至刻度，摇匀，即得。

2.3.3 阴性对照溶液的制备 按慢支咳喘膏的制法制备不含麻黄的提取物，照供试品溶液的处理方法制备溶液，即得。

2.3.4 系统适用性试验和专属性考察 分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10µL，注入色谱仪测定。结果，供试品溶液在与对照品溶液相同保留时间处出现色谱峰；阴性对照无干扰。色谱见图4。

图4 高效液相色谱图A.对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.盐酸麻黄碱；2.盐酸伪麻黄碱Fig 4 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test sample；C.negative control；1.ephedrine hydrochloride control；2.pseudoephedrine hydrochloride

2.3.5 线性关系考察 分别精密吸取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱对照品溶液2.0、4.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0 μL，按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，对照品进样量（X）为横坐标，制备标准曲线，得麻黄碱、盐酸麻黄碱的回归方程分别为Y＝28.691X－3.4197（r＝0.9997）、Y＝74.026X－0.781（r＝0.9998）。结果表明，麻黄碱、盐酸伪麻黄碱进样量在1.3～32.5、3.4～85µg范围内与其峰面积积分值呈良好线性关系。

2.3.6 精密度试验 分别吸取混合对照品溶液10µL，按上述色谱条件重复进样6次，测定峰面积。结果，盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱峰面积RSD分别为0.98%、0.76%，n均为6，表明仪器精密度良好。

2.3.7 稳定性试验 取供试品溶液适量，分别于0、1、3、6、9、12 h按上述色谱条件测定。结果，盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱峰面积RSD分别为0.94%、0.78%（n均为6），表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.3.8 重复性试验 取同一批号样品适量，共6份，按“2.3.2”项下方法制成供试品溶液，按上述色谱条件测定。结果，盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱峰面积RSD分别为0.68%、0.99%（n均为6），表明方法重复性良好。

2.3.9 加样回收率试验 分别精密称取已知盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱含量的样品（批号：20101025）9份，各约5 g，精密称定，分别依次精密加入0.1 mg·mL-1的盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱对照品溶液，使成为3个不同浓度的样品，按“2.3.2”项下方法制成供试品溶液。照上述色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表1、表2。

表1 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.3.10 样品含量测定 取3批供试品溶液适量，按上述色谱条件测定盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱含量，结果见表2。

3 讨论

黄芪的TLC鉴别中，曾采用超声法处理样品，但黄芪甲苷斑点不明显；曾将提取液上中性氧化铝柱纯化样品，黄芪甲苷斑点与杂质点重合，斑点也不明显。本试验中先用乙醚去杂质，再采用碱洗脱色；同时，由于正丁醇与水易发生乳化，所以先用正丁醇饱和碱液以加快洗脱；2005年版《中国药典》中展开系统为氯仿-甲醇-水（13∶7∶2）需低温分层后使用，耗能耗时，故采用氯仿-甲醇-水（6∶3∶0.5）系统展开，方法简单，Rf值适中。

表2 样品含量测定结果Tab 2 Results of content determination of samples

甘草的TLC鉴别中，曾尝试按2005年版《中国药典》方法以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）为展开剂，但样品中甘草酸铵对照品色谱相应位置有干扰，检视不明显，故采用本文中展开系统，甘草酸铵斑点清晰，无干扰。

本试验中曾尝试用氯仿作为提取溶剂制备供试品溶液，但乳化现象严重，损失量较大。而用浓氨水将样品调至碱性后，用乙醚萃取，回收率良好。

方中麻黄作为君药，具有发汗平喘的功效，用于治疗痹痛有良好的抗炎、镇痛效果[3]。盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱为麻黄中重要的化学成分，其中的盐酸伪麻黄碱具有良好的抗炎、镇痛作用[4，5]。为制定该制剂的质量标准，本研究选用盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱作为检测指标，以HPLC法测定2种成分的含量。本试验中采用乙腈-0.1%磷酸溶液（97∶3）为流动相，经方法学考察，此方法简单，专属性强、分离度好、且保留时间适宜，重现性、稳定性以及加样回收率良好。

[1]谢虞升，李汉保，宋炳生.对1995版黄芪薄层鉴别法的探讨[J].中草药，1999，3（30）：192.

[2]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：附录31、59.

[3]高哗珩，党力纳.麻黄研究进展[J].陕西中医学院学报，2003，6（20）：60.

[4]吴桂荣，王晓文.伪麻黄碱水杨酸盐的药用研究——镇痛、抗炎及对胃黏膜的刺激的考察[J].药学进展，2000，24（2）：107.

[5]吴桂荣，王晓文.伪麻黄碱水杨酸盐的药用研究——解热、对心率和血压及组胺所致刺激反应的影响[J].药学进展，2000，24（4）：238.