HPLC法测定活血散瘀灌肠液中丹参素的含量Δ

郑宇红，白学敏，黄剑（.浙江温州市中医院，温州市 35000；.浙江温州市医药科学研究所，温州市 35000）

活血散瘀灌肠液是浙江温州市中医院的协定复方中药制剂，由丹参、大血藤、三棱、莪术等药味经浸泡、蒸馏提取、浓缩、灭菌、灌装等工艺而制成。其具有活血化瘀、消肿止痛等功能，临床用于妇女盆腔炎性肿块的灌肠治疗。该制剂目前尚未制定含量测定指标，故笔者采用高效液相色谱（HPLC）法[1]建立了活血散瘀灌肠液中丹参水溶性成分丹参素的含量测定方法，以确保该制剂的质量[2]。

1 仪器与试药

1525型HPLC仪、2487型紫外检测仪（美国Waters公司）；AB204型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

丹参素钠对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110855-200508）；活血散瘀灌肠液（批准文号：浙药制Z20050273，批号：20100128、20100129、20100309、20100310、20100526、20100715）及阴性样品均由温州市中医院制剂室制备；甲醇为色谱纯，冰醋酸为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：甲醇-水-冰醋酸（7∶92.5∶0.5）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：280 nm；柱温：25℃；进样量：20µL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取丹参素钠对照品适量，用流动相稀释成含丹参素0.1 mg·mL-1的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

精密量取活血散瘀灌肠液1.00 mL，置10 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45µm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 阴性对照溶液的制备

除去丹参，按照活血散瘀灌肠液处方及制备工艺制得阴性样品。精密量取阴性样品1.00 mL，按“2.3”项下方法制成阴性对照溶液，即得。

2.5 系统适用性试验

取上述对照品溶液（含丹参素0.1 mg·mL-1）、供试品溶液与阴性对照溶液各20µL，按“2.1”项下色谱条件分别进样测定。结果表明，样品中其他成分对丹参素的测定无干扰；理论板数按丹参素钠峰计算为9004，分离度R＝2.78（＞1.5）。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.丹参素钠Fig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test sample；C.negative control；1.sodium danshensu

2.6 线性关系考察

精密量取对照品溶液（丹参素含量为0.1 mg·mL-1）1.00、2.00、5.00、7.00、10.00 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，得到含丹参素0.01、0.02、0.05、0.07、0.10 mg·mL-1的系列对照品溶液。用0.45µm微孔滤膜滤过，按上述色谱条件分别进样20µL，测定各系列对照品溶液中丹参素的吸收峰面积。以峰面积积分值（A）对浓度（c）进行线性回归，得回归方程为A＝14268340c－10057（r＝0.9999，n＝5）。结果表明，丹参素检测浓度在0.01～0.10 mg·mL-1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.7 精密度试验

精密量取对照品溶液（丹参素含量为0.02 mg·mL-1）20µL，按上述色谱条件连续进样5次，测定峰面积。结果，RSD＝0.41%（n＝5），表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验

取同批号的样品适量，照“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件分别进样，测定丹参素的含量。结果，样品中丹参素的平均含量为0.640 mg·mL-1，RSD＝1.09%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.9 稳定性试验

取同一供试品溶液适量，分别于0、6、12、18、24 h按上述色谱条件进样，测定峰面积。结果，RSD＝1.22%（n＝5），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.10 加样回收率试验[3]

精密量取已知含量（0.528 mg·mL-1）的同一批样品共6份，每份0.50 mL，分别置10 mL容量瓶中，再精密加入对照品溶液（丹参素含量为0.05 mg·mL-1）5.00 mL，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45µm微孔滤膜滤过，即得6份加样回收率供试溶液，按上述色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Result of recovery tests（n＝6）

2.11 样品含量测定

取6批样品，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，照上述色谱条件测定样品中丹参素的含量，结果见表2。

3 讨论

活血散瘀灌肠液为中药复方制剂，有一定的黏稠度，而待测成分含量不高，在对样品进行处理时，笔者用流动相稀释，采用普通滤纸过滤以除去不溶性杂质和干扰物质，再用0.45µm微孔滤膜过滤，可得到较满意的澄清供试品溶液。也曾采用高速离心（5000 r·min-1）后再用微孔滤膜过滤的方法处理，效果与前者相当，故采用前者处理。

表2 样品含量测定结果（n＝6）Tab 2 Results of content determination of sample（n＝6）

本试验最关键的一点是确定流动相。笔者参考相关文献[4～6]，比较了多种流动相对样品峰形和分离情况的影响，最后确定流动相为甲醇-水-冰醋酸（7∶92.5∶0.5）。若增加甲醇的量，会加快出峰时间，因此用甲醇来清洗色谱柱，以加速残留杂质尽快出峰；添加少量冰醋酸能使分离效果更好。

活血散瘀灌肠液成分复杂，检测条件下温度对分离效果和保留时间有一定的影响。经过比较试验，选择柱温25℃，既能避免出峰时间过长，又能得到分离效果满意并稳定的色谱图。

6批样品含量测定结果表明，活血散瘀灌肠液中丹参素的含量差异较大，这一方面与每批样品的原料差异有关；另一方面与生产工艺中浓缩定容的差异有关。

试验测得样品中丹参素的平均含量为0.509 mg·mL-1，因此建议活血散瘀灌肠液以丹参素为定量标准，即每1 mL含丹参素不少于0.4 mg（0.509×80%≈0.4），以保证其质量。

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录36-38.

[2]薛继雄，周 辉，刘 萌.高效液相色谱法测定消炎灌肠液中丹参水溶性成分的含量[J].医药导报，2005，24（1）：66.

[3]黄仕孙，王艳宁，高桂娥，等.中药退黄外洗液质量标准研究[J].中国药房，2010，21（15）：1399.

[4]张友芹，张春林，邵浩明，等.HPLC法测定丹参药材中丹参素的含量[J].中医药学报，2000，28（3）：68.

[5]唐旭利，刘 静，李国强，等.丹参药材水溶性成分HPLC化学指纹图谱研究[J].中成药，2008，30（3）：313.

[6]李 桃，王春娥.高效液相色谱法测定丹参药材中丹参素的含量[J].中国医院药学杂志，2005，25（9）：832.