RP-HPLC法同时测定复方益肾软胶囊中盐酸巴马汀、盐酸小檗碱和丹皮酚的含量Δ

陈娜，刘毅（1.天津市儿童医院，天津市 300074；.天津药物研究院，天津市 300193）

复方益肾软胶囊是由知母、黄柏、牡丹皮、山茱萸、杜仲等多味中药制成的复方制剂，具有滋阴降火、补益肝肾的功效。其有效成分为盐酸巴马汀、盐酸小檗碱和丹皮酚等。为了有效控制该制剂的质量，本试验应用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法同时对制剂中的有效成分盐酸巴马汀、盐酸小檗碱和丹皮酚进行含量测定[1～5]，方法简便、准确、重复性好，可作为该制剂的质控方法。

1 仪器与试药

HP1100系列HPLC仪，包括G1310A泵、G1313A自动进样器、G1316A柱温箱、G1314A VWD可变波长检测器、HP Rev.A.0501化学工作站（美国Agilent公司）；SD-3200型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

甲醇、乙腈均为色谱纯，水为去离子水，其他试剂均为分析纯；丹皮酚（批号：708-9003，供含量测定用）、盐酸巴马汀（批号：732-9002，供含量测定用）、盐酸小檗碱（批号：713-9906，供含量测定用）对照品均购自中国药品生物制品检定所；复方益肾软胶囊（天津市儿童医院制剂室自制，批号：20100201、20100202、20100203）。

2 方法与结果

2.1 检测波长的选择

取丹皮酚对照品溶液、盐酸巴马汀对照品溶液、盐酸小檗碱对照品溶液和流动相，在200～400 nm波长之间进行紫外吸收光谱扫描，发现最大吸收波长为265 nm，故选择265 nm作为同时测定这3种成分的检测波长。

2.2 色谱条件

色谱柱：Diamonsil-C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.03 mol·L-1磷酸二氢钾缓冲溶液（B，pH 3.10），梯度洗脱（0～30 min，27%A∶73%B→50%A∶50%B；30～35 min，50%A∶50%B→27%A∶73%B；35～40 min，27%A∶73%B→27%A∶73%B）；流速：1 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：265 nm。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液 （1）对照品贮备液的制备：精密称取盐酸巴马汀对照品5.19 mg、盐酸小檗碱对照品8.44 mg，置同一50 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为盐酸巴马汀和盐酸小檗碱对照品贮备液。精密称取丹皮酚对照品9.81 mg，置25 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为丹皮酚对照品贮备液。（2）混合对照品溶液的制备：精密吸取盐酸巴马汀和盐酸小檗碱对照品贮备液1 mL、丹皮酚对照品贮备液2 mL，置同一25 mL量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、丹皮酚的浓度分别为4.152、6.752、31.390 μg·mL-1）。

2.3.2 供试品溶液 取本品，研成细粉，取约0.4 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加入1%盐酸甲醇-水（7∶3）约20 mL，超声（功率：180 W，频率：35 kHz）提取30 min，取出，放冷，用相应溶剂稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm有机滤膜，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。

2.3.3 阴性对照溶液 按本品处方与工艺制备黄柏和牡丹皮缺味样品，照“2.3.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.4 方法专属性考察

在上述色谱条件下，分别取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，阴性对照在盐酸巴马汀、盐酸小檗碱和丹皮酚色谱峰位置处无相应峰出现；与其相邻的其他成分色谱峰达到基线分离，对含量测定结果无影响。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.混合对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.盐酸巴马汀；2.盐酸小檗碱；3.丹皮酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed control；B.test sample；C.negative control；1.palmatine hydrochloride；2.berberine hydrochloride；3.paeonolin

2.5 线性关系考察

分别精密量取盐酸巴马汀对照品贮备液（0.1038 mg·mL-1）与盐酸小檗碱对照品贮备液（0.1688 mg·mL-1）0.2、0.5、1.0、3.0、5.0 mL，置25 mL量瓶中，再分别精密量取丹皮酚对照品贮备液（0.3924 mg·mL-1）0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，置25 mL量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。分别进样20 μL，记录色谱图，读取峰面积。以进样量（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，制备标准曲线，得盐酸巴马汀的回归方程为Y＝4018Χ+1.52（r＝0.9999，n＝5）；盐酸小檗碱的回归方程为 Y＝5801.5Χ－95.2（r＝0.9999，n＝5）；丹皮酚的回归方程为Y＝5230.3Χ－10.03（r＝0.9999，n＝5）。结果表明，三者的进样量分别在0.01661～0.41520、0.02701～0.67520、0.15700～1.25570 μg范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验

取同一混合对照品溶液适量，连续进样6次，记录峰面积。结果，盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、丹皮酚峰面积的RSD分别为0.88%、0.61%、0.88%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

取同一批样品（批号：20100201）适量，研匀，精密称取6份，照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按样品测定方法进行测定。结果，盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、丹皮酚含量的RSD分别为1.17%、1.04%、0.66%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取同一供试品溶液适量，于室温下放置0、2、4、6、8、12 h，在上述色谱条件下测定，对照品随行。结果，对照品溶液中盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、丹皮酚峰面积的RSD分别为1.19%、0.77%、1.16%（n＝6）；供试品溶液中盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、丹皮酚峰面积的RSD分别为1.58%、0.71%、0.76%（n＝6），表明对照品溶液和供试品溶液在室温放置12 h内均稳定。

2.9 加样回收率试验

取同一批样品（批号：20100201）适量，研匀，精密称定6份，每份约0.2 g，分别置25 mL容量瓶中，加入0.5 mL盐酸巴马汀（0.1038 mg·mL-1）、盐酸小檗碱（0.1688 mg·mL-1）对照品溶液和1.0 mL丹皮酚（0.3924 mg·mL-1）对照品溶液，分别加入1%盐酸甲醇-水（7∶3）约20 mL，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，照样品测定方法进样测定，计算加样回收率，结果分别见表1～表3。

表1 盐酸巴马汀加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test of palmatine hydrochloride（n＝6）

表2 盐酸小檗碱加样回收率试验结果（n＝6）Tab 2 Results of recovery test of berberine hydrochloride（n＝6）

表3 丹皮酚加样回收率试验结果（n＝6）Tab 3 Results of recovery test of paeonol（n＝6）

2.10 样品含量测定

取3批样品（批号：20100201、20100202、20100203）适量，分别按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按上述方法测定盐酸巴马汀、盐酸小檗碱和丹皮酚的含量，结果见表4。

表4 样品含量测定结果（mg·g-1，n＝3）Tab 4 Results of content determination of samples（mg·g-1，n＝3）

3 讨论

3.1 提取溶剂的考察

称取样品适量，共4份，分别置25 mL量瓶中，分别加入不同的溶剂[70%甲醇、1%盐酸甲醇、甲醇-0.1%磷酸水溶液（1∶1）、1%盐酸甲醇-水（7∶3）]约20 mL，超声提取30 min，取出，放至室温，用相应溶剂稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm有机滤膜，弃去初滤液，取续滤液进行测定。结果表明，用1%盐酸甲醇-水（7∶3）作提取溶剂所测得样品含量最高，因此采用它作为提取溶剂。

3.2 提取方法的考察

称取样品适量，共5份，分别置25 mL量瓶中，分别加入1%盐酸甲醇-水（7∶3）约20 mL，采用不同的提取方法（加热回流30 min、振摇30 min、超声处理15 min、超声处理30 min、超声处理50 min）进行处理后放至室温，用原溶剂稀释至刻度，摇匀，过0.45µm有机滤膜，弃去初滤液，取续滤液进行测定。结果表明，振摇提取的各成分含量均较低；而对盐酸巴马汀和盐酸小檗碱而言，超声和加热回流的提取方法无明显差异，但对丹皮酚而言，加热回流对其含量有影响。因此，选定超声为提取样品的方法。进一步通过超声时间的比较发现，超声30 min时3种成分基本提取完全，故选定超声30 min为宜。

3.3 对含量测定的分析讨论

黄柏为本方君药，故选用其有效成分盐酸小檗碱与盐酸巴马汀作为含量测定指标，采用2005年版《中国药典》（一部）黄柏项下的含量测定方法，效果较好。

考虑将盐酸小檗碱、盐酸巴马汀和丹皮酚（牡丹皮的主要成分）采用同一流动相系统，比较了[1，2]乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液、乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾缓冲溶液与乙腈-0.1%磷酸（50∶50）每100 mL加十二烷基磺酸钠0.1 g 4种流动相系统。结果，前3种流动相系统下盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的保留时间适宜，而丹皮酚的保留时间大约在40 min，保留时间较长；第4种流动相系统能在很短的时间内将3种成分分开，但由于此系统中离子对的特性，使各组分保留时间很不稳定，在此基础上采用梯度洗脱的方法进一步试验，最后通过优化选择，确定出乙腈和0.03 mol·L-1磷酸二氢钾缓冲溶液两相进行线性梯度洗脱系统。

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：119.

[2]金佩芬，嵺华蓉，钱亚萍，等.HPLC法测定戊己丸中盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的含量[J].中成药，2001，23（1）：24.

[3]王曙东，宋炳生，陶建生，高效液相色谱法测定澄清剂处理黄柏水提液中小檗碱的含量[J].中草药，2000，31（12）：911.

[4]陈立新，蔡亚敏，刘凌云，等.高效液相色谱法测定肾康口服液中盐酸小檗碱的含量[J].中国药房，2005，16（2）：137.

[5]范俊安，于 超，王继生，等.重庆垫江牡丹皮丹皮酚含量动态变化研究[J].中国药房，2006，17（5）：394.