异莲心碱在大鼠体内的药动学研究

2011-05-23陈俊萍李向阳西宁市第二人民医院西宁市810003青海大学医学院西宁市810001

中国药房 2011年23期

陈俊萍，李向阳（1.西宁市第二人民医院，西宁市 810003；.青海大学医学院，西宁市 810001）

异莲心碱（Isoliensine）为睡莲属植物莲Nelumbo nucifer Gaertu的绿色胚芽中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱，具有抗心律失常、降压以及改善心血管功能等生物活性[1，2]。目前有关异莲心碱的报道多集中于药效学，对该药药动学研究较少。本研究旨在采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法测定大鼠静脉给予单剂量异莲心碱后血药浓度的变化，并探讨其药动学特点，为该药的临床前研究和评价以及今后的临床研究提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1200 HPLC仪，包括G1322A二极泵、G1315B二级管阵列检测器、G1316A色谱柱恒温箱、HP1100色谱工作站和G1329自动进样系统（美国安捷伦公司）；TDL-5型低温离心机（上海安亭医疗器械公司）；YKH型涡旋混合器（江西医疗器械公司）；KQ-250B型超声清洗器（江苏昆山超声波仪器有限公司）；BS124S型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1.2 试药

异莲心碱标准品（深圳美荷生物科技有限公司，批号：20080203，含量≥98.0%）；蝙蝠葛碱标准品（武汉远诚生物科技有限公司，批号：20070626，含量：≥98.0%）；甲醇和乙腈为色谱纯，三乙胺、甲基叔丁基醚均为分析纯，水为重蒸馏水。

1.3 动物

Wistar大鼠，♀♂兼半，体重（220±30）g，由中国医学科学院实验动物研究所提供（动物合格证号：SCXK（京）11-00-0006）。

2 方法与结果[3]

2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-0.05 mol·L-1KH2PO4＝22∶38∶40（三乙胺调pH值至7.5）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25 ℃；检测波长：280 nm；进样量：20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 异莲心碱标准品溶液精密称取异莲心碱标准品12.50 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.50 mg·mL-1的异莲心碱标准品贮备液。精密吸取该标准品贮备液适量，分别稀释定容至10 mL，配成浓度分别为10.00、25.00、50.00 μg·mL-1的系列溶液，4 ℃贮藏，备用。

2.2.2 蝙蝠葛碱标准品溶液精密称取蝙蝠葛碱标准品2.00 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得20.0 μg·mL-1的蝙蝠葛碱标准品贮备液，4℃贮藏，备用。

2.3 血浆样品处理

精密吸取离心后的大鼠血浆100 μL，置具塞玻璃试管中，加入3.0 mL甲基叔丁基醚，涡旋30 s，12000 r·min-1离心5 min，转移全部上清液于40℃N2吹干，残渣用100 μL流动相复溶，取50 μL进样分析。

2.4 方法专属性考察

空白血浆、空白血浆加入异莲心碱标准品和静脉给予异莲心碱后的血浆样品，按照“2.3”项下方法操作，进样分析。结果，异莲心碱和内标蝙蝠葛碱的保留时间分别约为6.5 min和11.0 min，分离度为3.50，峰形尖锐，无拖尾现象。相应的理论板数＞5000，血浆中的内源性物质不干扰体内异莲心碱含量测定。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白血浆；B.空白血浆加入异莲心碱标准品；C.iv异莲心碱30 min血浆样品；1.异莲心碱；2.蝙蝠葛碱Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma mixed with isoliensine；C.plasma sample 30 min after intravenous injection of isoliensine；1.isoliensine；2.dauricine

2.5 标准曲线的制备

精密吸取异莲心碱对照品溶液适量，加入空白血浆100 μL，配成异莲心碱浓度分别为0.50、2.00、5.00、10.00、15.00、25.00、40.00 μg·mL-1的血浆样品，按照“2.3”项下方法操作。以异莲心碱和蝙蝠葛碱的峰面积比值（A）对血浆中异莲心碱浓度（c）进行线性回归，得回归方程为A＝63.043c+3.937（r＝0.9998）。结果表明，异莲心碱检测浓度在0.50～40.00 μg·mL-1范围内与异莲心碱和蝙蝠葛碱的峰面积比值呈良好线性关系。在此条件下以S/N≥3计，异莲心碱在血浆中的最低检测浓度为0.10 μg·mL-1，最低定量浓度为0.50 μg·mL-1。

2.6 精密度试验

取空白血浆配制异莲心碱浓度分别为2.00、10.00、25.00 μg·mL-1的样品，按照“2.3”项下方法操作。每个质量浓度进行6份样本分析，连续测定3 d，以异莲心碱的峰面积用当日的回归方程求出质量浓度，将结果进行统计分析求算日内、日间精密度。精密度试验结果见表1。

表1 精密度试验结果（n＝6）Tab 1 Results of precision（n＝6）

2.7 提取回收率试验

取空白血浆配制异莲心碱质量浓度分别为2.00、10.00、25.00 μg·mL-1的系列血浆QC样本各6份，按“2.3”项下方法操作。记录异莲心碱峰面积为A1；另取一定量的异莲心碱标准品贮备液，配制成质量浓度分别为2.00、10.00、25.00 μg·mL-1的系列标准溶液各6份，以同体积进样，记录色谱图。异莲心碱的峰面积为A2，以（A1/A2）×100%计算提取回收率。提取回收率试验结果见表2。

2.8 稳定性试验

2.8.1 长期稳定性试验于空白血浆中加入一定量的异莲心碱标准品贮备液，配制成2.00、10.00、25.00 μg·mL-1的系列血浆QC样本各3份，于－20 ℃分别冷冻0、1、3、5、7、15、30、60 d后，取出待完全溶解后按“2.3”项下方法操作并记录异莲心碱峰面积，与0 d相比求得标准血浆样本的偏差。结果表明，标准血浆QC样本在－20℃条件下至少可以保持60 d稳定，相对偏差在－5.92%～4.28%内。

表2 提取回收率试验结果（n＝6）Tab 2 Results of extraction recovery（n＝6）

2.8.2 反复冻融稳定性试验于空白血浆中加入一定量的异莲心碱标准品贮备液，配制成2.00、10.00、25.00 μg·mL-1的系列血浆QC样本各3份，于－20℃冷冻24 h，取出待完全溶解后按照“2.3”项下方法操作，行HPLC分析并记录异莲心碱峰面积。反复冻融3次，与未冻融前相比求得标准血浆样本的偏差。结果表明，标准血浆QC样本在3次冻融条件下均保持稳定，相对偏差在－3.86%～5.70%内。

2.8.3 室温稳定性试验于空白血浆中加入一定量的异莲心碱标准品贮备液，配制成2.00、10.00、25.00 μg·mL-1的系列血浆QC样本各3份，于室温分别放置0、2、4、6、8、12、24 h后按“2.3”项下方法操作并记录异莲心碱峰面积，与0 h相比求得标准血浆样本的偏差。结果表明，标准血浆QC样本在室温放置24 h内可以保持稳定，相对偏差在－2.06%～3.37%内。

2.9 药动学研究

Wistar大鼠6只，♀♂兼半，体重（220±30）g，分别iv 25 mg·kg-1异莲心碱（给药前禁食不禁水12 h），并于给药后5、15、30、45、60、90、120、150、180、210、240、270 min尾静脉采血0.3 mL，肝素抗凝，12000 r·min-1离心5 min，取上清血浆100 μL，按“2.3”项下方法操作并记录异莲心碱峰面积。所得血药浓度-时间曲线数据采用中国药理学会数学专业委员会编制的DAS 2.0药动学软件计算参数。异莲心碱平均浓度-时间曲线见图2；异莲心碱在大鼠体内的主要药动学参数见表3。