桂枝对大鼠良性前列腺增生细胞增殖和凋亡的影响

洪 寅，仇凤梅，金国英，裘 洁，吕萃婷

良性前列腺增生症(benign prostatic hyperplasia，BPH)是中老年男性常见病。我们通过临床研究和实验研究发现，桂枝对BPH有明显疗效[1-3]。为进一步探寻其作用机理，本研究以大鼠BPH模型为实验对象，探讨桂枝对大鼠BPH细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 SD雄性大鼠，体质量180～220g，SPF级，由浙江中医药大学实验动物中心提供。动物合格证号:SYXK(浙)2008-0115。

1.2 药物 桂枝，浙江百草中药饮片有限公司,经生药学鉴定为樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的干燥嫩枝，批号20090301。桂枝水煎液由浙江中医药大学附属医院制剂室制备。保列治(非那雄胺)，美国默克公司，批号283199。丙酸睾丸素注射液，上海第九制药厂，规格1mL，50mg/mL，批号070703。兔抗鼠Ki-67多克隆抗体和二步法EnVi-sion组化试剂盒，DAKO公司产品，批号9106P121。TUNEL试剂盒，罗氏公司，批号11405490。

1.3 仪器 TC-15套式恒温器，新华医疗器械厂。HM335E半自动石蜡切片机，德国MICROM公司。JD801形态学显微图像分析系统，江苏省捷达科技发展有限公司。

1.4 大鼠BPH模型的制备和给药 取体质量180～220g的雄性大鼠60只，预养5 d，称重，随机分为6组，每组10只。分别为:正常对照组、模型组、阳性对照组(保列治0.45mg/kg，以非那雄胺含量计)、桂枝水煎液低剂量组(1.67 g/kg，以生药含量计，以下同)、桂枝水煎液中剂量组(3.33 g/kg)、桂枝水煎液高剂量组(6.67 g/kg)。除正常对照组，其余大鼠每天皮下注射丙酸睾丸素(5mg/kg)。并同时分别灌胃给药，正常对照组及模型组给予等体积离子净化水，每日1次，连续用药30 d。

1.5 前列腺指数的测定 于末次给药24 h后，称取各组大鼠体质量，解剖分离出大鼠前列腺，用分析天平称重，计算前列腺指数，前列腺指数=前列腺湿重/体质量（mg/g）。

1.6 前列腺病理学检查 将各组大鼠的前列腹叶组织经10%甲醛固定、石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察前列腺结构。

1.7 前列腺细胞增殖指数和凋亡指数检测 Ki-67免疫组化法检测细胞增殖:石蜡包埋组织标本做4 μm连续切片，石蜡切片脱蜡，水化，蒸馏水洗，0.1%胰酶消化20min(37℃)，PBS洗3次。3%H2O2阻断内源性过氧化物酶10min(室温)，PBS洗3次，滴加一抗，4℃过夜。PBS洗3次，滴加山羊抗鼠IgG抗体-HRP多聚体室温孵育30min，PBS洗3次，DAB显色液显色3min，显微镜下控制反应，自来水冲洗终止反应，Harris苏木素液复染细胞核1min，95%、100%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

TUNEL法检测细胞凋亡:石蜡包埋组织标本做4 μm连续切片，石蜡切片脱蜡，水化，PBS洗2次。蛋白酶K孵育15min(37℃)，PBS洗2次。加标记反应液孵育1 h(37℃)，PBS洗3次。加converter-POD反应30min(37℃)，PBS洗3次。加DAB底物反应10min(20℃)，PBS洗3次。用苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

阳性细胞计数:采用半定量方法进行结果判定，细胞核出现棕黄色或棕褐色为阳性细胞，10×40倍镜下随机选取5个视野计数。并计算细胞增殖指数和凋亡指数。

2 结果

2.1 前列腺指数 与正常组比较，模型组前列腺湿重和前列腺指数明显升高(P＜0.01)；与模型组比较，桂枝水煎液中、高剂量组大鼠的前列腺指数显著下降(P＜0.01)。见表1。

表1 桂枝水煎液对大鼠前列腺湿重及指数的影响()

表1 桂枝水煎液对大鼠前列腺湿重及指数的影响()

注:与正常组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别正常组模型组桂枝水煎液组高剂量组中剂量组低剂量组阳性对照组n 剂量(mg/kg)1010前列腺湿重(g)0.88±0.11.74±0.2△△前列腺指数(mg/g)2.37±0.25.29±0.6△△101010106670333016700.451.51±0.2*1.51±0.2*1.74±0.21.72±0.24.41±0.6**4.34±0.7**5.21±0.44.98±0.6

2.2 病理学观察 正常组光镜下可见腺体大小一致，很少有乳头状向腔内突起。上皮细胞排列整齐呈立方形，间质少，没有血管扩张充血。模型组上皮呈乳头状增生向腺腔内突出，呈锯齿状，上皮细胞呈高柱状、复层或假复层，平滑肌增厚，间质和血管扩张充血、水肿。桂枝水煎液中、高剂量组各种病理现象较阴性组都有很大的改观，腺体排列整齐，上皮细胞增生不明显，乳头状突起较少，细胞呈低柱状或扁平状，排列整齐，间质和血管扩张充血、水肿较轻。见图1。

图1 大鼠前列腺组织病理变化

2.3 前列腺细胞增殖指数和凋亡指数 Ki-67阳性染色定位于细胞核，呈棕黄色，多表达于前列腺上皮细胞，间质细胞中表达较少。凋亡细胞呈棕褐色，可见凋亡小体，主要检出于前列腺上皮细胞。与正常组比较，模型组大鼠前列腺增生细胞的凋亡指数明显升高(P＜0.05)，而增殖指数没有显著性差异(P＞0.05)；与模型组比较，桂枝水煎液中剂量组和高剂量组大鼠前列腺增生细胞的凋亡指数明显升高(P＜0.01)，而增殖指数没有显著性差异(P＞0.05)；与阳性对照组比较，桂枝水煎液中剂量组和高剂量组大鼠前列腺增生细胞的凋亡指数明显升高(P＜0.01)。详见图2、图3和表2。

图2 大鼠前列腺组织Ki-67表达变化

图3 大鼠前列腺组织凋亡细胞表达变化

表2 桂枝水煎液对大鼠前列腺细胞增殖指数和凋亡指数的影响()

表2 桂枝水煎液对大鼠前列腺细胞增殖指数和凋亡指数的影响()

注:与正常组比较，▲P＜0.05；与阳性对照组比较，△△P＜0.01；与模型组比较,**P＜0.01

组别正常组模型组桂枝水煎液组高剂量组中剂量组低剂量组阳性对照组n 6 6 6 6 6 6剂量(mg/kg)增殖指数(%)2.54±2.22.53±1.3凋亡指数(%)1.84±3.26.90± 1.6▲6670333016700.451.93±0.51.55±0.62.84±2.03.25±1.492.00± 3.5**△△73.39±17.9**△△32.26±28.927.84±24.5

3 讨论

BPH发病机制迄今尚未阐明。多数研究显示，BPH发生时前列腺细胞增殖增加、凋亡减少，提示细胞增殖增加和凋亡减少共同参与了BPH的发生[4]。细胞发生凋亡时，DNA链在内源性核酸内切酶作用下发生断裂，产生DNA片段，利用DNA断裂的3’-OH末端片段，由末端核苷酸转移酶介导采用dUTP末端标记技术可以在组织原位检测凋亡细胞。TUNEL法是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡最典型的生化和形态特征，特异性高，在细胞凋亡研究中被广泛采用[5]。本实验采用TUNEL法对凋亡情况进行研究，结果显示，桂枝水煎液中剂量组和高剂量组大鼠前列腺增生细胞的凋亡指数较模型组明显升高，表明桂枝对大鼠前列腺增生细胞具有促凋亡作用，且其作用明显优于阳性对照组(保列治)，这可能和两者对BPH作用机理不同有关，保列治(非那雄胺)是5α-还原酶抑制剂，主要通过调节性激素水平而抑制前列腺增生[6]。Ki-67核抗原与细胞增殖有关，为细胞增殖的一种标记，Ki-67增殖指数高低可以反映细胞的增殖状态[7]。本实验中，各组中的Ki-67增殖指数没有显著差异，表明桂枝对大鼠前列腺增生细胞没有明显抑制增殖的作用。

由本研究结果推断，桂枝可能是通过促进大鼠前列腺增生细胞凋亡，起到抗大鼠BPH的作用，其具体的促凋亡作用机制有待进一步阐明。

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