3'单肟靛玉红的药物代谢动力学研究

许利刚，张书刚，张仕林，张颖冬

上世纪70年代，中国医学家们在传统中成药当归芦荟丸中发现，青黛的抗肿瘤有效成分是靛玉红(Indirubin)，其对慢性粒细胞白血病的治疗已经用于临床［1-2］。靛玉红的衍生物对其他肿瘤的抑制作用也正在研究中［3-5］。目前已经清楚，靛玉红是一种选择性的Cdks抑制剂，是Cdk1、Cdk2和Cdk5的竞争性抑制剂［6］，它可以在纳摩尔水平抑制Cdk1、Cdk2和Cdk5的活性，但其水溶性和脂溶性都很差，且有一定的毒性。3'单肟靛玉红(Indirubin-3'-monoxime，IMX)是其衍生物之一。IMX不仅具有Cdks抑制剂的基本特点，而且有较好的膜通透性，可以与ATP竞争Cdks激酶的催化位点［7］。体外试验已经证实，其可以抑制引起tau蛋白过度磷酸化的GSK-3β和Cdk5/p25激酶活性。此外，在体外培养的小脑颗粒神经元上，IMX还可以通过剂量依赖性地抑制c-JunN末端蛋白激酶(JNK)减少细胞应激所致的凋亡［8］。此外，IMX可以抑制β淀粉样蛋白对SH-SY5Y细胞的毒性［9］。在最近的 AD 小鼠动物模型中［10］也证实，IMX可以改善小鼠的记忆能力并且减轻β淀粉样蛋白引起的病理学变化。IMX极有希望成为阻止AD进展的重要靶标。

鉴于Cdks抑制剂的研究已经从单纯的抗肿瘤作用扩展到神经系统及其他系统疾病的治疗，因此，对小分子Cdks抑制剂IMX相关药代动力学研究很有必要。本文应用高效液相色谱法，通过测定不同给药途径鼠血浆中IMX浓度，得出IMX的相关药代动力学参数，研究了IMX在鼠体内主要器官的分布，为进一步研究IMX在人体内药代动力学过程及药物的临床应用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠，体质量(300±20)g，购自南京医科大学实验动物中心。实验前均在卫生的环境中饲养，自由摄食、饮水。室温(20±2)℃。

1.2 主要仪器设备 CS-15R台式高速冷冻离心机:美国Beckman公司;Waters高效液相色谱:美国Waters公司;Waters 2487紫外检测器:美国Waters公司;Breeze型色谱工作站:美国Waters公司;Waters1525 Binary HPLC Pump:美国Waters公司;754P分光光度计:上海光谱仪器有限公司;DY89-1电动匀浆机:宁波新芝科学仪器研究所。

1.3 药品和试剂 IMX标准品，sigma公司购入，实验前用DSMO溶解稀释至所需浓度。

1.4 HPLC测定IMX的浓度

1.4.1 高效液相色谱(HPLC)条件 色谱柱为Hanbon-C18(5 μm，4.6 mm ×200 mm)，流动相为甲醇∶水(70∶30)，流速 1 mL/min，检测波长365 nm，柱温25 ℃，进样量为20 μL。

1.4.2 大鼠血浆样品的预处理［11］将每次收集的血样0.2 mL置于1.5 mL的离心管中(内含1%的肝素 0.5 μL，80 ℃ 烘干)，2 500转离心5 min，取上清液0.1 mL，加入0.2 mL乙腈，9 000转离心10 min，上清液20 μL测IMX的浓度。

1.4.3 标准曲线的制作 精确称IMX 10 mg，氯仿∶甲醇(1∶1)溶解，配制成浓度为1 mg/mL的贮备液(Ⅰ)。实验前取贮备液(Ⅰ)1 mL用氯仿∶甲醇(1∶1)稀释成浓度为10 μg/mL的贮备液(Ⅱ)。实验时分别取大鼠新鲜血浆1 mL，依次加入贮备液(Ⅱ)，配成浓度为 0.1、0.3、0.6、1.0、2.0、3.0和4.0 μg/mL的系列标准溶液，按血样处理的方法进行处理。按HPLC测定条件，分别测定IMX峰面积，绘制面积-浓度标准曲线，得到标准曲线方程A=a+b C。

1.4.4 回收率和精密度实验 分别取0.2 mL大鼠新鲜血浆，加入 IMX溶液，使其浓度分别为0.6、2.0、4.0 μg/mL，按与血样处理同法处理，HPLC测定回收率和日内、日间精密度。

1.4.5 大鼠血浆中IMX浓度的测定 分别取静脉注射、腹腔注射后的血样，按血样处理方法处理，取20 μL用HPLC法分别测其峰面积，从标准曲线上查得浓度，绘制浓度-时间曲线。

1.5 IMX药代动力学研究

1.5.1 静脉给药与采血方法 雄性SD大鼠10只，实验前用乙醚麻醉，尾静脉注射IMX 10 mg/kg(以DSMO为溶剂)，于注射IMX前及注射后2、5、10、15、20、30、45、60、90、120、180 和 240 min，分别由眼球后取血0.2 mL，置于肝素管中。

1.5.2 组织分布实验 大鼠42只随机分成7组，每组6只，一组处死取心、肺、肾、脑组织各2 g，按1∶1 加入生理盐水，15 000 r/min 匀浆 1 min，高速离心(10 000 g)5 min，取上清液0.2 mL，加入乙腈0.4 mL，10 000转离心10 min，上清液分别过膜，用HPLC法测定IMX浓度作为对照组。其他6组尾静脉注射 IMX 溶液 10 mg/kg，于 0.5、1、2、3、4和5 h分别处死，取心、肺、肾、脑组织各2 g，按上述方法同样处理，用HPLC法分别测定各组织中IMX的峰面积，应用上述标准曲线查得浓度，绘制浓度-时间曲线。

1.6 数据处理 血药浓度-时间数据分别按照一室、二室、三室模型，运用Marquardt法迭代拟合，通过对模型拟合的评价，利用F检验法及根据AIC最小的原则选出最佳模型，采用中国药理学会编3P87程序，计算药代动力学参数。

2 结果

2.1 血药浓度测定方法的确证

2.1.1 IMX的光谱特征 紫外光谱扫描结果显示，IMX在365 nm处有一个吸收峰，所以选定365 nm作为检测波长。按 HPLC法测定表明，IMX的保留时间为4.437 min(见图1)。

图1 大鼠血浆IMX色谱图注:A.空白血浆，B.空白内标，C.IMX 10 mg/kg iv 10 min;1.IMX，2.solvent

2.1.2 标准曲线和线性范围 HPLC测定IMX的线性范围为0.14～4.0 μg/mL。标准曲线方程为 A=75.440 5 C-1.166 4，r=0.999 16。

2.1.3 回收率和精密度实验 将回收率实验样品测定值代入标准曲线方程，计算出IMX浓度，以测定值与实际值之比计算回收率。0.6、2.0和4.0 μg/mL 3种浓度的日内平均相对回收率为99.05%、98.85%和97.12%。日内精密度RSD＜3%(n=5)，日间精密度RSD＜4%(n=5)，符合目前生物分析方法指导原则的要求。

2.2 IMX的药时曲线和药代动力学参数 大鼠尾静脉注射IMX后，各时间点IMX的血药浓度均在检测范围内，IMX的平均血药浓度-时间曲线见图2。用3P87药代动力学软件对IMX在大鼠体内的血药浓度分别按照一室、二室、三室模型运用Marquardt法迭代拟合，对拟合结果进行比较，其中二室模型为最优模型。IMX的药代动力学方程为C=1.37e-0.0731t+0.29e-0.0048t，药代动力学参数见表1。

图2 IMX平均血药浓度-时间曲线

表1 静脉给与IMX 10 mg/kg的药物动力学参数

2.3 组织分布研究 大鼠尾静脉注射IMX后，IMX在各组织中的平均浓度-时间曲线见图3。IMX在肺组织中的分布0.5 h达高峰，而后降低;IMX在脑中的分布0.5 h达高峰，而后逐渐降低;IMX在心脏组织中的含量较高，1 h达到高峰，而后逐渐降低;IMX在肾脏组织中的分布显示，在3 h达高峰，而后迅速降低。

图3 3'单肟靛玉红10 mg/kg静脉给药后的组织分布

3 讨论

本研究方法采用甲醇∶水(70∶30)作为流动相，用HPLC-UV法测定大鼠血浆中IMX的浓度，血浆中的内源性物质不干扰IMX的测定，IMX的保留时间为4.437 min，操作省时、简便、精密度及重现性均较好。

尾静脉注射IMX后，大鼠尾静脉注射IMX后的药代动力学过程用开放的二室模型来描述较为合理。T1/2α为 9.70 min，α 为 0.073/min，β 为0.004 8/min，T1/2β为 129.26 min，远大于 T1/2α，说明IMX在体内以消除过程为主。K12大于K21，说明IMX从中央房室向外周房室转运速率大于从外周房室向中央房室的转运速率。稳态表观分布容积 Vss［=VC(1+K12/K21)］为 35.807 L/kg，中央室表观分布容积VC为9.605 L/kg，中央室表观分布容积占总表观分布容积的29.27%，说明药物主要分布在体循环和血流丰富的组织中。一方面可能由于IMX属脂溶性物质，易溶于有机组织;另一方面，可能是IMX在大鼠体内经过肝脏的首关消除转化为其他物质，因而在血浆中测定的浓度较低，其原因有待进一步研究。

药物进入血液从血流向中枢神经系统分布，主要在药物进入细胞间隙和脑脊液时受到限制。脑组织的毛细血管内皮细胞紧密相连，不具有多数组织毛细血管内皮组织之间的小孔和吞饮小泡，而且外表面几乎全为星形胶质细胞包围。这种结构特点，使得某些大分子、脂溶性差或解离度大的药物难于进入脑组织。药物能否进入脑组织，取决于药物的脂溶性和解离度［12］。根据IMX的化学结构特点，其脂溶性高，解离度小，较易进入脑组织。大鼠尾静脉注射IMX后，IMX在脑中的分布0.5 h达高峰，而后逐渐降低，说明IMX进入脑组织时，易于透过血脑屏障，可能以被动扩散为主，需要进一步研究加以证实。大鼠静脉注射IMX后，IMX在大鼠的肺、心脏、肾脏组织中的分布结果显示，IMX在肺组织中的分布0.5 h达高峰，而后降低;IMX在心脏组织中的含量较高，1 h达到高峰，而后逐渐降低;IMX在肾脏组织中的分布显示，在3 h达高峰，而后迅速降低。通过研究IMX在大鼠体内的药代动力学过程及其在大鼠体内的分布，为IMX的临床应用提供了重要依据，但在不同种属动物体内的药物代谢过程以及病理情况下的药物代谢过程还有待进一步研究。

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