三氧化二砷抑制重组白细胞介素13促成纤维细胞胶原的表达

肖 莉，王 煜，张凌志，李振华

肺纤维化已知病因包括过敏原、化学药品、辐射以及粉尘。然而最常见的肺纤维化—特发性肺纤维化(IPF)的病因仍然不清，尚无特效治疗药物。目前认为，慢性炎症导致趋化因子、细胞因子、生长因子分泌失衡，尤其是当白细胞介素13大量分泌时，引起机体由正常炎症愈合过程转变为致肺纤维化的病理过程［1］。因此，寻求有效药物逆转白细胞介素13等致肺纤维化的关键介质引起的内环境紊乱，可能预防和有效阻止肺纤维化的发生、发展。

三氧化二砷(Arsenic trioxide，As2O3)治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)已取得较好疗效［2］。目前研究表明，As2O3不仅抑制肿瘤细胞增殖和促进凋亡，同样对嗜酸粒细胞［3］、巨噬细胞［4-5］以及中性粒细胞［6］等炎性细胞的增殖具有抑制作用。笔者在先期试验中，证实As2O3抑制3T3成纤维细胞增殖和促进细胞凋亡［7］;IL-13能促进成纤维细胞增殖、分泌炎性介质和增强Ⅰ型胶原的表达［8］。本研究在此基础上，进一步观察 As2O3对IL-13促成纤维细胞增殖及分泌胶原是否有抑制效应，为治疗肺纤维化寻求新途径。

1 材料和方法

1.1 材料 细胞及试剂:NIH3T3细胞株由中国医科大学生物化学及分子生物学教研室提供。0.1%As2O3注射液由哈尔滨伊达药业提供。四甲基偶氮唑兰(MTT)由Sigma公司提供(PBS稀释成12 mmol/L过滤除菌，4℃避光保存)。兔抗小鼠Ⅰ型胶原一抗购自美国Rocland公司;HRP-羊抗兔IgG(二抗)，武汉博士德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将NIH3T3细胞接种于含体积分数10%胎牛血清、无抗生素的DMEM培养瓶中，置于37℃、体积分数5%的CO2培养箱，饱和湿度下培养。试验选用对数生长期、0.2%台盼蓝拒染率＞95%的细胞。

1.2.2 MTT检测 取对数生长期3T3细胞，调整细胞数为2×105/mL，每孔200 μL，加入96孔板中，37℃(5%体积分数)CO2培养24 h，弃去培养基，分别加入80 ng/mL rIL-13+不同干预浓度的As2O3溶液各 200 μL(As2O3浓度分别为 0、2、4 μmol/L)培 养 24、48 h，其 中 80 ng/mLrIL-13DMEM组作为对照组。每孔中加入MTT 15 μL，继续培养3 h，加入 DMSO 100 μL，于 490 nm处测定吸光度值。每组干预液及对照组均重复做5孔对照。药物作用效应即抑制率(%)=(1-实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)×100%。

1.2.3 细胞分组 3T3成纤维细胞调为2×105/mL，种植于培养瓶中(75cm2)。贴壁后弃去培养液，分别加入DMEM(对照组)、rIL-13(80 ng/mL)及rIL-13+不同浓度(2 μmol/L和 4 μmol/L)的 As2O3溶液各200 μL，共同孵育细胞48 h。

1.2.4 Western blot方法检测3T3成纤维细胞I型胶原表达 以GAPDH为内参照，收集各组细胞悬于500 μL冰冷缓冲液，冰浴中将细胞超声粉碎，4℃12 000×g/min离心1 h，弃沉淀。吸取上清，考马斯亮蓝法测定样本中蛋白浓度。样品中加入样品缓冲液，沸水煮5 min。上清(每个样品取20 μL)用7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分离。BIO-RAD电泳板，双板条件:150 V，30 mA。转印:硝酸纤维素膜在转印液中平衡10 min，然后遵循胶在负极、膜在正极的原则，经2 h 50 V的转印后TTBS洗膜3次，每次5 min。封闭:用含5%脱脂牛奶封闭2 h。一抗孵育:封闭后TTBS洗2次，转至兔抗小鼠Ⅰ型胶原(CoI)单克隆抗体(1∶5 000)4℃过夜，TTBS洗2次(5 min)。二抗孵育:转到HRP标记羊抗兔IgG(1∶5 000)的二抗中，室温孵育2 h，TTBS洗2次(5 min)，TBS 5 min。检测:用ECL化学发光检测，X光片感光。混合A液和B液，按照0.125 mL/cm2的标准。PBS洗后的膜放在混合液中，蛋白面向上，室温下1 min。暗室中X光片曝光，洗片。

2 结果

2.1 MTT 结果表明，As2O3抑制IL-13诱导的3T3细胞增殖(用细胞抑制率表示)，且抑制作用呈量效和时间依赖关系(P＜0.01)。见表1。

表1 As2O3对3T3细胞增殖的抑制作用(%，n=5)

2.2 Western blot法 结果显示，DMEM(对照组)、rIL-13(80 ng/mL)及 rIL-13+不同浓度的As2O3(2 μmol/L 和 4 μmol/L)组成纤维细胞均可检测到Ⅰ型胶原。rIL-13组分泌胶原的量显著高于对照组，不同浓度As2O3+rIL-13组的成纤维细胞Ⅰ型胶原的表达显著低于rIL-13组。其中，4 μmol/L As2O3+rIL-13 组与2 μmol/L As2O3+rIL-13组相比，细胞分泌胶原的水平差异无统计学意义。见图1。

图1 不同组别3T3成纤维细胞的I型胶原表达注:A.DMEM对照组;B.rIL-13;C.rIL-13+As2O32 μmol/L;D.rIL-13+As2O34 μmol/L

3 讨论

肺纤维化是多种病因引起的肺异质性疾病，主要病理特点是早期弥漫性肺泡炎、后期大量成纤维细胞病理性增生及细胞外基质进行性集聚并取代正常的肺组织结构，最终导致肺功能丧失。目前研究表明，在纤维化的起始阶段，Th1/Th2细胞因子失衡，Th2占优势，从而激活成纤维细胞，促进成纤维细胞增殖及细胞外基质沉积。IL-13是一种多效能Th2免疫调节因子。在IL-13单独被抑制的几个实验模型中，证实IL-13是组织纤维化的主要致病因子［9］。先期研究结果表明［10］，IPF患者外周血及支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-13水平均较对照组显著增高，而且BALF IL-13水平与其用力肺活量(FVC)、动脉血氧分压(PaO2)、一氧化碳弥散(DLCO)呈负相关。体外实验表明，IL-13能促进成纤维细胞增殖、分泌炎性介质和增强Ⅰ型胶原的表达［8］。

As2O3是中药砒霜的主要成分，作用包括:刺激分化，诱导细胞凋亡，抑制增殖和抑制血管生成［11］。鉴于As2O3在治疗肿瘤方面的疗效已得到共识，人们将研究对象不断扩展到除肿瘤细胞以外的人体细胞。Han等［12］用As2O3干预不同种细胞，如子宫颈癌Hela细胞、牛肺动脉上皮细胞、人肺成纤维细胞等，观察细胞的生长、死亡情况。先期试验中，Hochest荧光染色及透射电镜下可见As2O3作用后的3T3细胞具有早、中期凋亡形态学特征:细胞膜结构完整、细胞浆浓缩及染色质边集、固缩。MTT法证实，As2O3可显著抑制成纤维细胞增殖;使细胞周期G0/G1期比例增加，G2/M期减少，细胞阻滞在G0/G1期。本试验结果表明，As2O3对IL-13促成纤维细胞增殖功能表达有抑制作用，表明As2O3可能部分通过抑制Th2细胞因子对成纤维细胞的增殖功能而发挥治疗肺纤维化作用。

慢性肺纤维化主要与Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原相关。有研究显示［13］，C57BL/6鼠摄取含低剂量As2O3的水5周和8周后，基因芯片检测肺组织RNA水平。与对照组相比，弹性蛋白和胶原基因转录表达水平显著下降。提示人类低剂量接触As2O3，可能对肺纤维化的发生发展有抑制作用。同样，本实验表明，As2O3对IL-13促成纤维细胞Ⅰ型胶原表达有抑制作用，说明在肺纤维化的发生、发展阶段，As2O3可能通过拮抗Th2细胞因子对成纤维细胞分泌胶原的功能而发挥治疗肺纤维化的作用，但作用机制有待于进一步研究。

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