硅胶柱层析-RP-HPLC法同时测定火麻仁中3种大麻酚类化合物的含量Δ

夏林波，郭莹，邓仕任（辽宁中医药大学药学院，大连市 116600）

火麻仁又名大麻仁、麻子仁，为桑科植物大麻Cannabis sativa L.的干燥成熟果实[1]，始载于《神农本草经》，是一味亦药亦食的润下药，具有润燥滑肠、活血之功效，在临床上广泛用于治疗肠燥便秘、血虚津亏等证。同时，由于其还含有丰富的脂肪油和麻仁球蛋白，具有较高的营养价值，近年来在保健食品领域的应用也日益广泛[2]。然而，火麻仁有“小毒”，一次性大剂量服用火麻仁（30～60 g）会产生恶心、呕吐、四肢麻木、昏迷、瞳孔散大等中毒症状，这主要与其含有一类对神经系统起强烈致幻作用的物质——大麻酚类物质有关[3]。研究表明，火麻仁中含有60余种大麻酚类化合物[3]，但主要成分为以下3种:Δ9-四氢大麻酚、大麻酚和大麻二酚，其中Δ9-四氢大麻酚对中枢神经的作用最强，且能与另2种成分进行相互转化。因此，严格控制火麻仁中该3种成分的含量具有重要意义。

到目前为止，对该类成分进行质量控制的研究主要集中在大麻树脂提取物[4，5]和火麻仁油脂[6，7]上，而对火麻仁整体药材中大麻酚类化合物的含量测定却鲜有报道[8]，更未见对该3种主要成分同时进行含量测定的研究。由于火麻仁在临床使用中都是以整体药材入药，因此直接测定整体药材中大麻酚类物质的含量就显得尤为重要。此外，由于火麻仁中含有大量油脂[9]，其对大麻酚类成分的测定会造成严重的干扰，因此在采用高效液相色谱（HPLC）法进行含量测定之前，必须采用适当的预处理方法进行样品的纯化。基于上述分析，本试验通过硅胶柱层析纯化技术，结合反相高效液相色谱（RP-HPLC）法，对火麻仁整体药材中的3种大麻酚类化合物进行含量测定，以为火麻仁的质量控制与临床合理安全用药提供参考依据。

1 仪器与试药

Agilent 1100 Series HPLC仪，包括在线真空脱气机、低压四元梯度泵、柱温箱、紫外检测器、Agilent LC色谱工作站（美国安捷伦科技有限公司）；AR2140电子分析天平（上海力能电子仪器有限公司）；Milli Q纯水系统（美国密理博公司）；RE-52CS旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；U-3010紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；舒美KQ2200超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率:100 W，工作频率:40 kHz）；HH-4数显恒温水浴锅（常州国华仪器有限公司）。

大麻二酚（批号:1235-9907）、大麻酚（批号:171234-200809）、Δ9-四氢大麻酚（批号:171236-200609）对照品均购自中国药品生物制品检定所，以甲醇溶解，使成浓度均为1mg·mL-1的对照品溶液；乙腈为色谱纯（天津科密欧化学试剂有限公司），水为超纯水（18.2 MΩ·cm），其他试剂均为分析纯；柱层析硅胶（200～300目，青岛海洋化工有限公司）；13批不同产地的火麻仁药材，均经辽宁中医药大学鉴定教研室翟延君教授鉴定为桑科植物大麻C.sativa L.的干燥成熟果实。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（150mm×4.6mm，5 μm）；流动相:乙腈-水（68∶32）；流速:1.0mL·min-1；检测波长:220 nm；柱温:30℃；进样量:10μL。在此色谱条件下，大麻二酚、大麻酚、Δ9-四氢大麻酚的理论板数均不低于10000，分离度与拖尾因子均符合含量测定要求。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.混合对照品；B.未经硅胶柱纯化的样品；C.经硅胶柱纯化的样品；1.大麻二酚；2.大麻酚；3.Δ9-四氢大麻酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed control；B.test sample without purification；C.test sample after purification；1.cannabidiol；2.cannabinol；3.Δ9-tetrahydrocannabinol

2.2 对照品溶液的制备

分别精密吸取适量大麻二酚、大麻酚、Δ9-四氢大麻酚对照品溶液（浓度均为1mg·mL-1），分别转移至10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成质量浓度均为40μg·mL-1的对照品溶液。

分别精密吸取大麻二酚对照品溶液5mL、大麻酚对照品溶液2.5mL、Δ9-四氢大麻酚对照品溶液2.5mL，转移至同一10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成质量浓度分别为20、10、10μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取火麻仁药材粉末（过40目筛）约10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100mL，称定重量，冷浸30min后，超声振荡提取30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，过滤，取滤液。残渣重复提取2次，合并3次滤液后减压浓缩至近干，残留物用甲醇溶解并定容至2mL。取硅胶25 g，用适量淋洗剂（氯仿∶石油醚＝4∶1，V/V）调匀后湿法装入层析柱中，再精密吸取0.5mL火麻仁甲醇溶液上柱，加入淋洗剂洗脱。收集50～100mL段洗脱液，将所得溶液减压浓缩至干，残留物用甲醇溶解，转移至1mL量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液1、5、10、15、20、25 µL，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下进样分析。以峰面积积分值（Y）对绝对进样量（X，µg）进行线性回归，制备标准曲线，得3种活性成分的回归方程、相关系数及线性范围，详见表1。

表1 线性关系考察结果（n＝6）Tab 1 Result of linear regression examination（n＝6）

2.5 精密度试验

取同一混合对照品溶液适量，在上述色谱条件下连续进样6次，记录各自峰面积。结果，大麻二酚、大麻酚、Δ9-四氢大麻酚峰面积的RSD分别为2.1%、1.2%和2.4%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一份火麻仁药材（广西产）样品粉末适量，共6份，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，计算含量。结果，大麻二酚、大麻酚、Δ9-四氢大麻酚含量的RSD分别为2.2%、1.0%和2.4%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取同一火麻仁药材（广西产）供试品溶液适量，室温放置，分别于0、4、8、12、24h进样分析，记录各自峰面积。结果，大麻二酚、大麻酚和Δ9-四氢大麻酚峰面积的RSD分别为1.8%、1.2%和2.4%（n＝5），表明供试品溶液在24h内稳定。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的火麻仁药材（广西产）粉末6份，每份约2 g，精密称定，分别精密加入一定量的大麻二酚、大麻酚和Δ9-四氢大麻酚对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 2 Result of recovery experiments（n＝6）

2.9 样品含量测定

分别称取不同来源的火麻仁药材粉末（过40目筛）约10 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，采用外标法以峰面积计算大麻二酚、大麻酚和Δ9-四氢大麻酚的含量，结果见表3。

表3 13批次样品的含量测定结果（μg·g-1，n＝3）Tab 3 Result of content determination of 13 batches of samples（μg·g-1，n＝3）

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

试验比较了Agilent XDB-C18、Agilent SB-C18、Agilent SB-C8、Shim-pack VP-ODS 和Dikma Diamonsil-C18等多种固定相系统，以及乙腈-水、乙腈-0.1%醋酸水、甲醇-水和甲醇-0.1%醋酸水等多种流动相系统。结果表明，以Agilent XDB-C18为固定相、乙腈-水为流动相，所得色谱图分离度较好、基线平稳、检测时间较短。再分别对所测3种成分对照品溶液在200～400 nm波长范围内进行紫外扫描，结果大麻二酚、大麻酚和Δ9-四氢大麻酚均在220 nm波长处有最大吸收，故在220 nm波长下进行含量检测。

3.2 样品提取条件的优化

由于大麻酚类化合物受热易分解，因此本试验选择了超声提取法；并对不同提取溶剂（甲醇、乙醇以及不同比例的甲醇-水、乙醇-水溶液）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15，W/V）、提取时间（15、30、45min）、提取次数（2、3、4次）等因素进行了考察。结果表明，采用10倍量甲醇超声3次，每次提取30min，可以将大麻酚类成分提取完全，同时可将提取液中的油脂含量降到最低。

3.3 样品的纯化

由于火麻仁中含有丰富的油脂，因此即使采用甲醇萃取，也很难完全不提取出脂类成分，而脂类成分的存在对于大麻酚类的检测造成了严重的干扰，如图1 B所示，在油脂成分的干扰下，3种大麻酚类成分几乎已经无法检出，这主要是由大麻酚类化合物既具有醇溶性，又具有脂溶性的特点造成的。当浓缩后的提取物中含有较多油脂时，加入的少量甲醇并不能使大麻酚类物质充分地从油脂中萃取出来，因而也就无法在HPLC系统中进行有效的检测。由此可见，在分析测定前必须对样品进行脱脂处理，以消除脂类成分的干扰，而常用的石油醚或乙醚的脱脂方法必然会造成脂溶性大麻酚类化合物的大量损失，为此本试验采用了硅胶柱层析的方法对样品进行纯化。

试验考察了氯仿、乙酸乙酯、石油醚以及不同比例的混合溶剂的纯化效果，最终选用氯仿-石油醚（4∶1，V/V）的混合溶剂作为淋洗剂，25 g硅胶湿法装柱，将所得馏分分段收集，以HPLC监测。结果表明，大麻酚类物质完全集中于50～100mL段流出。收集该段馏分，挥干溶剂后已无明显油状物，加一定量甲醇溶解，进HPLC检测，所得色谱图如图1C所示。可见，经硅胶柱层析纯化后，3种大麻酚类化合物均可顺利检出，且峰形对称、基线平稳，均能达到基线分离（R＞1.5）。

3.4 测定结果分析

从表3可以看出，不同来源的火麻仁中3种大麻酚类成分含量差异较大:来自四川、广西的火麻仁中大麻二酚的含量较高，而Δ9-四氢大麻酚的含量较低；来自内蒙古、河北张家口的火麻仁中Δ9-四氢大麻酚的含量较高。这与Haney等[10]的研究结果相符，该文作者认为可能是由于植物的不同生长环境造成的。另据有关资料[11]，大麻可分为纤维型和药用型2种类型，前者Δ9-四氢大麻酚的含量较低，而后者则含量较高，本试验测定结果的显著性差异也有可能受到这种因素的影响。

3.5 限量标准

美国Par Pharmaceutical公司的口服抗呕吐药Marinol的有效成分即为Δ9-四氢大麻酚，其对人体中枢神经系统产生不良反应的口服剂量为0.4mg·kg-1（28mg/70 kg）；《中国药典》中所规定的火麻仁的使用量为10～15 g，结合火麻仁中Δ9-四氢大麻酚的实际测定结果，初步拟定火麻仁药材中的主要毒性成分Δ9-四氢大麻酚的含量不得超过10μg·g-1。

4 结论

合理的样品前处理不仅可以使待测成分有效地检出，还能够减少杂质对色谱柱的损害[12]。本试验通过硅胶柱层析的前处理方法有效地除去了干扰成分，继而采用RP-HPLC法对13批不同产地的火麻仁药材中3种具有中枢神经活性的大麻酚类化合物（大麻二酚、大麻酚、Δ9-四氢大麻酚）进行了同时测定。本方法操作简便，结果准确、稳定，且重复性好，可为火麻仁的质量控制及临床合理安全用药提供参考依据。

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