HPLC法测定多聚甲醛牙髓失活剂中盐酸可卡因含量

林瑶，杨敏茹，郭飞燕，王荣，王晓娟#a，顾宜#b（.第四军医大学第三附属医院药剂科，西安市 7003；.陕西省新药评审中心，西安市 70065）

盐酸可卡因为局部麻醉药，具有麻醉止痛作用，应用广泛，是常用牙髓失活剂的主要成分，但同时也是一种具有成瘾作用的毒品。多聚甲醛牙髓失活剂主要有效成分为多聚甲醛和盐酸可卡因，具有破坏牙髓神经纤维素及髓鞘，使牙髓细胞坏死和止痛防腐等作用。其与砷失活剂相比，毒副作用小，制剂中盐酸可卡因每次使用量约1.5mg，且在牙髓失活后由操作医师取出，无成瘾性，临床使用多年，安全、方便，作为医院标准制剂收载于《中国人民解放军医疗机构制剂规范》（2002年版）[1]中。该制剂原质量标准中采用分光光度法测定盐酸可卡因含量，但因该制剂基质复杂，萃取步骤多，导致测定结果不稳定。为了更好地控制该制剂的质量，保证用药安全，本文采用高效液相色谱（HPLC）法测定盐酸可卡因的含量，结果表明，所建立的方法简便、灵敏、快速，结果准确、可靠。

1 仪器与试药

LC-2010A HT HPLC仪、UV-VIS检测器、LC-solution工作站（日本岛津公司）；A210P电子天平（德国Sartorius公司）。

多聚甲醛牙髓失活剂（第四军医大学第三附属医院制，批号:100301、100402、100709，盐酸可卡因含量:7%）；盐酸可卡因对照品（青海制药厂有限公司，批号:20090401，含量:99.8%）；甲醇为色谱纯，水为纯化水，三乙胺、磷酸等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Diamonsil C18（150mm×4.6mm，5µm）；流动相:甲醇-0.5%三乙胺溶液（磷酸调pH值至4.5）＝30∶70；检测波长:235 nm；流速:1.0mL·min－1；柱温:25 ℃；进样量:10 µL。取“2.2”项下对照品、供试品和空白溶液进样分析，结果，盐酸可卡因在上述色谱条件下能有效分离，理论板数大于3000。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.对照品；B.供试品；C.空白；1.盐酸可卡因Fig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test samples；C.blank sample；1.cocaine hydrochloride

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液。精密称定干燥至恒重的盐酸可卡因对照品20.26mg，加甲醇溶解并定容至50mL容量瓶中，制成浓度为405.2µg·mL－1的盐酸可卡因对照品贮备液。精密量取该贮备液10mL至50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得浓度为81.04 µg·mL－1的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液。取本品约0.3 g，精密称定，置于锥形瓶中，加甲醇溶解，过滤至50mL容量瓶中，加甲醇冲洗滤渣及锥形瓶，洗液滤过并入锥形瓶中，加甲醇至刻度，精密量取10mL，置于50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 空白溶液。根据该制剂处方制备不含盐酸可卡因的空白样品，按“2.2.2”项下方法制备空白溶液。

2.3 线性关系考察

分别精密量取对照品贮备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0mL，置于25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，进样10µL，按“2.1”项下色谱条件测定盐酸可卡因峰面积，以盐酸可卡因浓度（c）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程A＝23006c+418.4（r＝0.9997）。结果表明，盐酸可卡因检测浓度线性范围为16.208～129.664µg·mL－1。

2.4 精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下制备的对照品溶液10µL，重复进样6次，测得盐酸可卡因峰面积的RSD为1.15%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

精密吸取“2.2”项下制备的对照品溶液及供试品溶液，各进样10 µL，考察其在0、2、4、8、12、24h内的稳定性，各进样6次。结果对照品峰面积的RSD为1.58%，供试品峰面积的RSD为1.18%（n＝6），表明对照品和供试品溶液在24h内基本稳定。

2.6 重复性试验

取样品（批号:100709）6份，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样10µL。计算得盐酸可卡因的平均含量为7.003%，RSD为1.36%（n＝6），表明此方法重复性好。

2.7 加样回收率试验[2]

精密称定本品0.3 g，置于锥形瓶中，分别精密加入相当于所称样品中盐酸可卡因理论含量（经测定，批号为100709的样品中盐酸可卡因含量为7.003%）80%、100%、120%的盐酸可卡因对照品，每个浓度制样3份，共9份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样、测定，计算回收率及RSD，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果Tab 1 Results of recovery tests

2.8 样品含量测定

取3批多聚甲醛牙髓失活剂样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样10µL测定，记录色谱，按外标法计算含量。结果，3批样品中盐酸可卡因含量分别为7.164%、7.029%、7.011%（分别为标示量的102.34%、100.41%、100.16%），平均含量为7.068%（为标示量的100.97%）。

3 讨论

盐酸可卡因的测定方法有非水滴定法、间接原子吸收分光光度法、旋光法、毛细管区带电泳法、三阶倒数光谱法、一阶导数光谱法等[3～8]。因上述方法操作复杂，计算方法烦琐，本文选择操作过程简便、直观、快捷的HPLC法测定制剂中盐酸可卡因含量。根据文献[9]，盐酸可卡因在235 nm波长处有较大吸收，经测定在该波长下盐酸可卡因检测灵敏度高，故选择235 nm为检测波长。该文献应用流动相0.04 mol·L－1磷酸盐缓冲液（含有0.26mmol·L－1四丁基铵盐，pH3.2）-乙腈＝83∶17测定动物血清中可卡因的含量。另有文献[10]采用流动相为乙腈-0.02 mol·L－1磷酸二氢钾溶液（用0.1 mol·L－1氢氧化钾溶液调节pH值至4.6）＝40∶60，测定可卡因类似物盐酸辛可卡因的含量。笔者试用上述流动相，但即使调整各流动相组分比例，效果也均不是很理想，且成本较高。考虑到可卡因为含氮碱性化合物，在流动相中添加扫尾剂三乙胺可改善峰形，经试验不同比例三乙胺和pH值，最终采用甲醇-0.5%三乙胺溶液（磷酸调pH值至4.5）＝30∶70作为流动相，结果所得峰形、理论板数、分离度等均较好。试验中发现，制备对照品、供试品溶液，用水为溶剂时稳定性不好，溶液放置8 h浓度下降约8%。考虑到盐酸可卡因在甲醇中溶解度也较好，因此采用甲醇作溶剂，以克服溶液稳定性差的问题。另外，试验中发现，进样量大于12µL时，峰形开始变差，进样量为20µL时，峰形难以确认，但原因不明，因此，本文试验选用进样量为10µL。

[1]中国人民解放军总后勤部卫生部编.中国人民解放军医疗机构制剂规范[S].2002年版.北京:人民军医出版社，2003:278.

[2]吴 阳，郭伟英.HPLC法同时测定黄连羊肝丸中黄芩苷和盐酸小檗碱的含量[J].中国药房，2010，21（36）:3442.

[3]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（二部）[S].2010年版.北京:中国医药科技出版社，2010:645.

[4]李先强.间接原子吸收分光光度法测定盐酸可卡因的含量[J].理化检验-化学分册，1992，28（6）:366.

[5]李 君，张良志，邓文章.旋光法测定盐酸可卡因溶液的含量[J].中国药学杂志，1993，28（1）:30.

[6]霍秀敏.毛细管区带电泳法分离八种成瘾药物[J].西北药学杂志，1995，10（2）:54.

[7]原永芳，袁 芳，黄 瑾，等.三阶倒数光谱法同时测定鲍宁氏液中盐酸可卡因和苯酚的含量[J].华西药学杂志，2000，15（5）:375.

[8]杨翰春，原永芳，王增福.牙髓失活剂的制备及质量标准的研究[J].总装备部医学学报，2003，12（3）:45.

[9]孙 林，宋 君，何 威，等.高效液相色谱法测定小鼠血清中可卡因的含量[J].中国法医学杂志，2002，17（3）:165.

[10]黄 澜，黄剑英.HPLC法测定复方聚甲酚磺醛软膏中盐酸辛可卡因的含量[J].海峡药学，2008，20（8）:48.