环氧合酶－2在胃癌淋巴结转移灶中的表达及其与生存素和细胞核增殖抗原的关系

檀碧波，李 勇，韩 杰，范立侨，刘 羽，张志栋

在胃癌的发生发展中，环氧合酶－2(cyclooxygenase－2，COX－2)与肿瘤细胞的增殖、凋亡关系密切［1－2］，但这些研究多在原发灶或细胞系中进行，而对淋巴结转移灶中COX－2的表达与肿瘤细胞增殖、凋亡的关系尚不明确。由于肿瘤演进过程中在多个方面出现异质性变化，研究转移/残留病灶中COX－2的表达与增殖和凋亡相关因子的表达，对针对转移和(或)残留病灶为目标的治疗更具临床意义。故本研究对胃癌原发灶及淋巴结转移灶中COX－2的表达及其与生存素 (Survivin)、细胞核增殖抗原 (Ki－67)表达的关系进行研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2008年10月—2009年8月在我院手术并经病理证实伴淋巴结转移的胃癌40例，其中男22例，女18例;年龄45～77岁，平均 (62.9±10.0)岁。患者术前均未接受放化疗。每例肿瘤原发灶、相应淋巴结转移灶标本均经中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片，经苏木精－伊红染色行病理诊断。

1.2 方法 采用免疫组化染色法 (SP法)分别对肿瘤原发灶和淋巴结转移灶进行COX－2、Survivin、Ki－67染色，染色步骤严格按试剂盒说明书进行操作。用PBS代替一抗做阴性对照，用已知阳性切片做阳性对照。鼠抗人COX－2及Survivin、Ki－67单克隆抗体及免疫组化试剂盒均购自北京中杉生物公司 (美国ZYMED公司产品)。

1.3 结果判断 由两位病理医师分别双盲阅片进行结果判断。每张切片随机取10个高倍视野 (×400)，每视野计数100个细胞，COX－2、Survivin以细胞膜和 (或)细胞质着染呈黄色为染色阳性，Ki－67以细胞核着染呈黄色为染色阳性。按肿瘤细胞着色强度和阳性细胞率分别进行记分;细胞增殖水平以Ki－67标记指数 (labeling index，LI)表示［3］。着色强度记分:无着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。肿瘤细胞阳性细胞率记分标准:阳性细胞≤5%为0分，6%～25%为1分，26% ～50%为2分，51% ～75%为3分，≥76%为4分。两种记分标准所得分值的乘积为0或1表示阴性 (－)，2～3为弱阳性 (+)，4～7为阳性 (++)，≥8为强阳性 (+++)。表达强度标准:记分≤3为弱表达，≥4为强表达。Ki－67 LI为计算出每张切片上的阳性表达百分数，即为Ki－67标记指数。

1.4 统计学方法 采用SAS8.0统计分析软件进行统计检验。计数资料采用McNemar'sχ2检验，计量资料采用t检验，各指标间表达的相关性采用双变量相关分析。p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌淋巴结转移灶、原发灶间COX－2、Survivin、Ki－67表达强度比较 COX－2、Survivin在原发灶中强表达率分别为52.5%(21/40)、70.0%(28/40);在淋巴结转移灶中强表达率分别为72.5%(29/40)、72.5%(29/40)。经Mc-Nemar'sχ2检验，COX－2在淋巴结转移灶中的表达显著高于原发灶，差异有统计学意义 (χ2=4，P=0.046);Survivin在两种病灶中的表达强度比较差异无统计学意义 (χ2=0.0667，P=0.796，见表1)。原发灶中Ki－67 LI(58.9±22.4)显著高于淋巴结转移灶 (50.6±20.8)，差异有统计学意义 (t=－2.17，P=0.04)。

双变量相关分析显示，原发灶中COX－2的表达与淋巴结转移灶中COX－2的表达呈正相关 (r=0.3484，P=0.0276);Ki－67 LI在两种组织中的表达亦呈正相关 (r=0.5817，p＜0.0001);但两种组织中Survivin的表达则无明显相关性 (r=0.1816，P=0.262)。

2.2 原发灶与淋巴结转移灶中COX－2表达与Survivin、Ki－67的关系 在原发灶中，COX－2的表达与Survivin、Ki－67的表达呈正相关 (r值分别为 0.6954和0.6084，P均 ＜0.0001);Survivin与Ki－67的表达也呈正相关 (r=0.6402，p＜0.0001)。淋巴结转移灶中，COX－2的表达与Ki－67的表达呈正相关 (r=0.3350，P=0.035)，但COX－2与 Survivin、Survivin与Ki－67均无相关性 (r=0.2993，P=0.061;r= －0.0298，P=0.855)。

表1 COX－2、Survivin在胃癌原发灶及淋巴结转移灶中的表达 (例)Table 1 The expression of COX－2，Survivin in primary tumor and lymph node metastases of gastric carcinoma

3 讨论

胃癌的发生、侵袭、转移、耐药等生物学行为均与细胞增殖和凋亡失调密切相关。环氧合酶 (cyclooxygenase，COX)是一种膜结合蛋白，有COX－1和COX－2两个亚型，而COX－2与肿瘤的发生、侵袭及淋巴结转移的关系已得到部分证实［4］。Krysan等［5］研究发现，特异性的COX－2抑制剂能明显减少Survivin的表达、肿瘤细胞凋亡增多;其他相关研究也证实COX－2表达与肿瘤细胞的增殖和凋亡有关［1，5］。本研究结果显示，COX－2在胃癌淋巴结转移灶中的表达与原发灶中的表达呈正相关，提示COX－2可能在胃癌的转移过程中起作用;同时COX－2在淋巴结转移灶中的表达强度显著高于原发灶，表明胃癌淋巴结转移灶中COX－2的表达已发生了异质性变化。由于肿瘤切除后复发的根源是残留和 (或)转移灶［6］，进展期胃癌淋巴结转移率高达60%～80%，已成为影响预后的独立因素，故研究淋巴结转移灶中COX－2的表达具有重要意义。

Survivin可通过抑制Caspase阻止细胞凋亡，是目前已知分子量最小的凋亡抑制蛋白［7］，有强大的凋亡抑制作用。本研究发现，Survivin在胃癌淋巴结转移灶中的表达强度与原发灶中的表达强度既无显著差异，也无相关性，提示Survivin在原发灶、淋巴结转移灶胃癌细胞的凋亡抵抗中发挥重要作用，可能成为胃癌生物治疗的新靶点;同时结果也提示淋巴结转移灶中Survivin的表达多发生了异质性变化，以原发灶中Survivin表达情况预测转移灶中的表达是不准确的。分析COX－2与Survivin的关系发现，原发灶中COX－2与Survivin的表达呈正相关，而在淋巴结转移灶中COX－2则与Survivin的表达则失去了这种关系。这说明COX－2可通过调控Survivin的表达抑制肿瘤细胞的凋亡;同时也表明淋巴结转移灶与原发灶相比，诸多基因、大分子事件的异质性变化过程更为复杂，COX－2并非调控胃癌Survivin蛋白表达和功能的惟一因素，这一过程是多种与凋亡相关的基因/蛋白共同参与而实现的［8］。

Ki－67是反映细胞增殖的因子，是目前应用最广泛、能准确反映增殖活性的指标［9－10］。本研究结果显示，胃癌原发灶中Ki－67 LI显著高于淋巴结转移灶，说明胃癌淋巴结转移灶的肿瘤细胞增殖活性低于原发灶，提示胃癌转移过程中肿瘤的增殖活性与原发灶不同;结果还发现，两种组织的Ki－67表达强度呈正相关，说明肿瘤转移过程中Ki－67的变化可能存在一定规律性，但这种变化的具体情况及意义尚待继续研究。Schmitz等［11］研究发现COX－2与肿瘤细胞的增殖有密切关系，本研究也发现COX－2与Ki－67在胃癌原发灶及淋巴结转移灶中均表现出明显的相关性，说明COX－2确与肿瘤细胞增殖有关，COX－2可能通过调控Ki－67来影响胃癌细胞的增殖活性。

本研究初步证实COX－2在胃癌淋巴结转移灶中的表达与原发灶比较，已经出现异质性变化，且COX－2可能通过影响Survivin和Ki－67的表达来参与胃癌细胞的增殖、凋亡过程，故检测淋巴结转移灶中COX－2的表达对研究胃癌转移过程中肿瘤细胞增殖、凋亡的变化有一定价值，但具体调控机制尚待进一步研究。

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