肠炎冲剂调节胃肠功能及止泻作用的动物实验研究

丁海峰,曹永兵,刘洪涛,牟 斌,姜远英(第二军医大学药学院药理学教研室)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一组与自身免疫相关的肠道炎症性疾病,好发于乙状结肠和直肠。临床症状以腹痛、腹泻、黏液、脓血便和里急后重为主,发病机制尚不明确,病程缠绵,反复发作,是胃肠道的疑难病。近年来,其发病率呈明显上升趋势,但目前尚无特异性治疗方法[1]。临床主要采用激素和水杨酸制剂治疗,症状严重时合用抗生素,由于严重不良反应的存在,均无法长期用药,因此开发新的安全有效的治疗药物显得十分迫切。肠炎冲剂是由黄柏、地锦草等制成的复方制剂,临床应用于治疗UC多年。本研究进一步证实了肠炎冲剂对实验动物胃肠的调节功能及止泻作用。

1 材料和方法

1.1 仪器 张力换能器和PowerLab数据记录与分析系统(澳大利亚AD Instruments公司);麦氏浴槽(江苏省张家港市青松生物医学仪器有限公司);Lambda25型可见-紫外分光光度计(美国PerkinElmer公司)。

1.2 试剂和药品 番泻叶(上海雷允上中药饮片厂);蓖麻油(第二军医大学长海医院药学部自制,批号020909);盐酸小檗碱(上海利生制药厂,批号Y-001-0001);羧甲基纤维素钠(CMCNa,中国医药集团上海化学试剂有限公司,批号F20050913,用蒸馏水配成所需浓度);阿托品注射液(上海禾丰制药有限公司,批号020101,用0.5%CMCNa配成0.01 mg/ml的溶液);甲硫酸新斯的明注射液(规格:0.5 mg/ml,上海信谊金朱药业有限公司,批号020401);氯化乙酰胆碱(中国医药集团上海化学试剂有限公司,批号 20020122,用三蒸水配成0.4 mg/ml的溶液);酚红(上海三爱思试剂有限公司,批号990122,用 2%CMCNa配成0.7 mg/L溶液)。肠炎冲剂由第二军医大学药学院药理学教研室自制,用0.5%CMCNa碾磨混悬均匀,分别配成1.14 、0.57、0.29 g生药/ml的药液。

1.3 动物 SD大鼠[清洁级,第二军医大学实验动物中心,动物合格证号:SCXK(沪)2002-0006],雌雄各半,体重250～300 g;ICR小鼠[清洁级,中国科学院上海实验动物中心,动物合格证号:SCXK(沪)2002-0010],雌雄不限,体重18～22 g;白色家兔[第二军医大学实验动物中心,动物合格证号:SCXK(沪)2005-0003],雌雄各半,体重1.8～2.2 kg。

1.4 大鼠正常小肠推进运动的实验[2]取50只SD大鼠,按体重以数字化随机法分为5组,各组给药体积均为10 ml/kg体重。肠炎冲剂高、中、低剂量组分别灌胃给予1.14、0.57、0.29 g生药/ml的肠炎冲剂溶液,即高、中、低剂量组的给药剂量分别为11.4、5.7、2.9 g生药/kg体重。空白对照组灌胃给予0.5%CMCNa溶液,阳性对照组灌胃给予0.01 mg/ml的阿托品溶液。每天给药1次,连续3 d,进行碳末推进实验前,大鼠禁食过夜。末次给药1 h后,灌胃给予活性炭混悬液(用0.5%CMCNa配成0.1 g/ml混悬液)10 ml/kg体重,30 min后断颈处死大鼠,打开腹腔,分离肠系膜,剪取幽门至回盲部的肠管置于托盘上,轻轻将小肠拉成直线,测量肠管长度作为小肠总长度。以幽门至炭末前沿的距离作为炭末在肠内推进距离,计算炭末推进百分率和药物的抑制率。炭末推进百分率=[炭末在肠内推进距离/小肠总长度]×100%,药物的抑制率=[(空白对照组炭末推进百分率-给药组炭末推进百分率)/空白对照组炭末推进百分率]×100%。

1.5 小鼠推进机能亢进小肠运动的实验[2]取ICR小鼠 60只,雌雄各半,按体重以数字化随机法分为6组,各组给药体积均为15 ml/kg体重。给药组分别灌胃给予1.14、0.57、0.29 g生药/ml的肠炎冲剂溶液,则给药剂量分别为17.1、8.6、4.3 g生药/kg体重。模型对照组和空白对照组均灌胃给予0.5%CMCNa,阳性对照组灌胃给予0.01 mg/ml的阿托品溶液,每天给药 1次,连续3 d。末次给药1 h后,除空白对照组外,其余各组均皮下注射新斯的明0.1 g/kg体重造模,15 min后进行炭末推进实验,计算炭末推进百分率和药物的抑制率。炭末推进百分率计算与1.4项下相同。药物的抑制率=[(模型对照组炭末推进百分率-给药组炭末推进百分率)/模型对照组炭末推进百分率]×100%。

1.6 家兔离体十二指肠平滑肌活动的实验[3,4]取家兔40只,雌雄各半,按体重以数字化随机法分为5组,即空白对照组、阳性对照组(阿托品)及肠炎冲剂高、中、低剂量组,每组8只。所有家兔在实验前禁食24 h,击头致死,立即剖腹,取出一段十二指肠,迅速于冷台氏液中保存。实验时剪取1.5 cm肠段,悬吊在37℃、39 ml台氏液的麦氏浴槽中(pH值7.2～7.4),通100%氧气,静息张力0.5 g,平衡0.5 h后开始实验,以张力换能器测定肌内收缩力,用PowerLab进行数据记录与分析。(1)对家兔离体十二指肠平滑肌自发活动的影响 按上述操作后,描记正常收缩曲线,各组分别加入1.14、0.57、0.29 g生药/ml肠炎冲剂药液,阿托品溶液和0.5%CMCNa各1 ml,描记加药后的收缩曲线。(2)对氯化乙酰胆碱所致肠痉挛的影响 按上述操作常规制备家兔离体肠标本,描记正常收缩曲线,然后在浴槽内加入0.4 mg/ml氯化乙酰胆碱0.2 ml(终浓度为2 μ g/ml),引起肠管痉挛,待其平稳后,向浴槽内分别加入1.14、0.57、0.29 g生药/ml肠炎冲剂药液、阿托品溶液和0.5%CMCNa各1 ml,描记加药后收缩曲线。

1.7 大鼠胃排空实验[5]取SD大鼠40只,按体重以数字化随机法分为5组,各组给药体积均为10 ml/kg体重。空白对照组灌胃给予0.5%CMCNa溶液,阳性对照组灌胃给予1 mg/ml的阿托品溶液,肠炎冲剂高、中、低剂量组分别每天灌胃给予1.14、0.57、0.29 g生药/ml的肠炎冲剂药液,连续3 d。胃排空实验前大鼠禁食过夜。末次给药后2 h,每只大鼠灌胃给予0.07%酚红溶液1.5 ml,15 min后处死大鼠,立即取胃,将胃内容物洗在10 ml蒸馏水中,3.0×103g离心 10 min,取上清液在546 nm波长测定吸光度。另取10 ml蒸馏水加入0.07%酚红溶液1.5 ml,离心后测定其546 nm的吸光度作为基础值,计算胃内酚红残留率。胃内酚红残留率=(各组 A546值/基础 A546值)×100%。

1.8 止泻实验[6](1)番泻叶致泻实验 造模前1 d用番泻叶25 g加水300 ml,直火煎煮15 min,用纱布过滤,在水浴锅上浓缩成1 g/ml溶液备用。取ICR小鼠60只,雌雄各半,按体重以数字化随机法分为6组,各组给药体积均为15 ml/kg体重。空白对照组和模型对照组灌胃给予0.5%CMCNa溶液,阳性对照组 予1.0的 酸 檗碱,肠炎冲剂高、中、低剂量给药组分别灌胃给予浓度为1.14、0.57、0.29 g生药/ml的肠炎冲剂药液,即给药剂量分别为17.1、8.6、4.3 g生药/kg体重,连续5 d。除空白对照组外,各组于末次给药后1 h口服番泻叶煎液0.02 ml/g体重。每鼠单笼放置,笼底垫干净滤纸,每小时换1次纸,计数5 h内干粪数和湿粪数,计算稀便率。稀便率=(稀便数/总便数)×100%。(2)蓖麻油致泻实验 另取 ICR小鼠 60只,雌雄各半,按体重以数字化随机法分为6组。各组给药剂量与番泻叶致泻实验相同,每天给药1次,连续5 d。除正常对照组外,其余各组均于末次给药后1 h口服蓖麻油0.02 ml/g体重,记录粪便数量并计算稀便率。

2 结 果

2.1 对正常大鼠小肠推进运动的影响 空白对照组平均炭末推进百分率为(72.01±5.77)%,肠炎冲剂高、中、低剂量组和阳性对照组(阿托品)的平均炭末推进百分率为(53.93±5.71)%、(65.98±7.94)%、(68.10±6.98)%和(66.24±5.61)%,抑制率分别为25.11%、8.37%、5.43%和8.01%。肠炎冲剂高、中剂量组和阳性对照组的炭末推进百分率与空白对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.001),表明高、中剂量的肠炎冲剂和阿托品均能显著抑制大鼠正常小肠的推进运动。肠炎冲剂低剂量组的炭末推进百分率与空白对照组相比差异无统计学意义,但仍显示抑制趋势。

2.2 对小鼠推进机能亢进小肠运动的影响 肠炎冲剂对ICR小鼠推进机能亢进小肠运动的影响实验中,空白对照组和模型对照组的平均炭末推进百分率分别为(66.29±16.04)%和(77.46±13.94)%,肠炎冲剂高、中、低剂量组和阳性对照组(阿托品)的平均炭末推进百分率分别为(54.98±7.07)%、(69.20±7.25)%、(70.79±10.98)%和(74.79±15.38)%,药物的抑制率分别为29.02%、10.66%、8.61%和 3.45%。皮下注射新斯的明0.1 g/kg体重能引起ICR小鼠小肠推进机能亢进。肠炎冲剂高剂量组的炭末推进百分率与模型对照组相比差异有统计学意义,表明高剂量的肠炎冲剂能显著抑制新斯的明导致的推进机能亢进小肠的运动机能,肠炎冲剂中、低剂量组及阳性对照组与空白对照组相比差异无统计学意义,但仍有抑制推进机能亢进小肠运动的趋势。

2.3 对家兔离体十二指肠平滑肌活动的影响 阳性对照组和肠炎冲剂高、中剂量组对家兔平滑肌自发活动的收缩张力与空白对照组相比差异有统计学意义,说明阿托品和高、中剂量的肠炎冲剂能显著抑制家兔离体十二指肠段自发活动。阳性对照组和肠炎冲剂高、中剂量组对氯化乙酰胆碱所致肠痉挛的收缩张力与空白对照组相比,差异有统计学意义,说明肠炎冲剂和阿托品均能显著抑制氯化乙酰胆碱所致肠痉挛,结果见表1。

表1 肠炎冲剂对家兔离体十二指肠平滑肌收缩张力的影响Table 1 The effect of Changyan granules on contraction tension of isolated duodenal smooth muscle in rabbits

表1 肠炎冲剂对家兔离体十二指肠平滑肌收缩张力的影响Table 1 The effect of Changyan granules on contraction tension of isolated duodenal smooth muscle in rabbits

*P＜0.05,***P＜0.001,与空白对照组比较

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2.4 对大鼠胃排空的影响 空白对照组和阳性对照组大鼠的胃内残留率分别为(46.79±32.13)%和(97.06±24.96)%,两组相比差异有统计学显著意义(P＜0.01),说明10 mg/kg体重的阿托品能显著抑制大鼠的胃排空功能。肠炎冲剂高、中、低剂量组的胃内残留率分别为(40.33±25.94)%、(27.75±10.96)%和(36.06±18.24)%,与空白对照组相比差异无统计学意义,说明各剂量的肠炎冲剂对SD大鼠的胃排空功能没有影响。

2.5 止泻效果 (1)对番泻叶致泻的止泻效果 空白对照组未见稀便,模型对照组的稀便率为(80.11±14.99)%,表明番泻叶煎液能诱导小鼠腹泻。阳性对照组(盐酸小檗碱)和肠炎冲剂高剂量组的稀便率分别为(51.43±23.61)%和(60.15±15.95)%,与模型对照组相比差异有统计学意义。肠炎冲剂中、低剂量组的稀便率分别为(73.34±13.75)%和(71.36±16.08)%,与模型对照组相比差异无统计学意义,但仍有止泻趋势,并呈一定的剂量相关性。(2)对蓖麻油致泻的止泻效果 空白对照组未见稀便,模型对照组的稀便率为(81.44±14.23)%,表明蓖麻油致泻造模成功。肠炎冲剂高、中、低剂量组和阳性对照组的稀便率分别为(72.51±17.13)%、(71.01±13.20)%、(76.86±17.08)%和(71.03±10.43)%,与模型对照组相比差异无统计学意义,稀便率与剂量的相关性也不明显。

3 讨 论

近年来,中医药治疗UC取得一定进展,但疗效好的内服中药较少。肠炎冲剂是在民间验方基础上经删改而成的复方制剂,其中的黄柏、地锦草等具有抗菌、抗炎、抗溃疡,以及免疫调节作用,临床常用于治疗肠炎、菌痢等疾病。以往的研究表明,肠炎冲剂能够明显缓解UC模型大鼠的腹泻症状,降低结肠组织髓过氧化物酶活力,改善结肠组织病理学改变,使溃疡面积明显缩小,缓解水肿[7]。本研究结果表明,肠炎冲剂对大鼠正常小肠及推进机能亢进小鼠的小肠运动均有明显抑制作用,能显著抑制离体家兔十二指肠平滑肌的收缩运动和氯化乙酰胆碱所致肠痉挛,可能由于药方中含有的黄柏碱成分具有轻度的筒箭毒样作用,能抑制由乙酰胆碱引起的收缩反应。止泻实验结果显示,肠炎冲剂对番泻叶所致的小鼠腹泻有止泻作用,但对蓖麻油引起的腹泻无明显效果。分析原因可能与蓖麻油除了刺激小肠,增加肠蠕动,促进排泄外,还具有一定的润肠作用有关。此外,肠炎冲剂对胃功能未见明显影响。总之,本研究结果为肠炎冲剂的临床应用提供了理论依据。

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