基于压电传感技术的鲜奶总菌数快速检测方法研究

汪学英，孙明伟，顾 锋，吴金男，尹 凡

（常熟理工学院 化学与材料工程学院，江苏 常熟 215500）

微生物对食品的污染问题是我国乃至全世界食品安全中最突出的问题.牛奶营养丰富，但易腐败、变质[1]，其中含有很多潜在的有害微生物，这些微生物可以破坏牛奶质量，危害饮用者身体健康[2-4].细菌总数既是评价牛奶质量最重要的污染指标之一，也是最主要的质量控制项目，建立及时、准确、快速、适用于奶站收购时“卸载”检测的牛奶中微生物检测方法是牛奶卫生检验中的一个十分重要的内容.

传统的微生物检测技术非常繁琐，需要耗费大量的人力物力，而且检测周期长、灵敏度低，难以满足目前国内外对食品安全检测的要求[5，6].串连式压电传感器因具有稳定、灵敏、操作简便等优点[7，8]，已被应用于微生物的检测[9，10]，但已有的文献都集中在串连式压电传感器对单一菌种的测定[11-13].本实验是基于在微生物作用下牛奶发生凝结，使牛奶的粘密度发生变化从而使石英晶体谐振频率发生突变，而凝固的时间与牛奶中微生物的初始浓度存在线性关系，因此通过检测牛奶凝结时间可以实现对牛奶中总菌数的间接测定.本方法的准确性与传统的平板计数法相当，但更快速、简便.

1 材料与方法

1.1 实验仪器

石英晶体微天平（QCM922，Seiko，Japan）、9MHz的 AT切型石英晶片（Seiko，Japan）；净化工作台 S·SW-CJ·2F型（上海博泰实验设备有限公司）；全自动不锈钢双层立式电热蒸汽压力消毒器YX.400Z型（上海三申医疗器械有限公司）；电热恒温干燥培养箱303A-3S型（上海浦东荣丰科学仪器有限公司）；PHS－3C型pH计（上海精密仪器厂）.

1.2 实验材料

菌种：嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）由常熟理工学院生物与食品工程学院发酵工程技术研究中心提供.

培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，121℃高压灭菌20分钟.牛奶：常熟市圣力乳业有限公司和市售.实验所用水均为二次蒸馏水.

1.3 实验方法

仪器检测：用浓硫酸和双氧水（3:1）的混合液处理电极表面，蒸馏水冲洗净后吹干，连同检测池在75%酒精中浸泡，无菌水冲洗，加入一定量的灭菌牛奶.检测电极插入检测池中，待温度达到设定温度时，用无菌微量进样器或吸量管向检测池中接入不同浓度的细菌悬液，开机检测.设定每5 min一个点，跟踪测定，得到一系列数据.

平板实验：标准平板计数实验同步进行，作为对照.对样品进行梯度稀释，取合适的稀释样1 mL于无菌培养皿中，每梯度做3个平行，加入融化并冷却至50℃的营养琼脂培养基并摇匀，待凝固后置于37℃的培养箱中倒置培养48 h，然后对平板上的菌落进行计数，推算样品中细菌浓度.

以上操作均于无菌环境中进行.

2 结果与讨论

2.1 实验原理

压电传感器不仅对质量敏感，而且对液体的力学性质，如粘度、密度、应力、弹性模量等的变化也非常敏感[7].压电石英晶体谐振频率的改变值与介质的密度和粘度之间的关系可用如下公式[7]表示：

上式表明，△f随（ρLηL）1/2增加而降低（式中ρL、ηL分别为介质的密度和粘度，ρq为石英晶体密度，μq为石英剪切模量）.

作为液相介质的鲜乳在微生物作用下发酵产酸，牛奶的流变性和粘度发生变化，从而产生凝结现象.由于粘、密度增大，引起压电晶体石英晶振的频率下降.当开始凝结时频率急降，这个频率急降的转折点定义为检测时间（FDT）.微生物含量越多，到达FDT所需的时间越短，两者存在如下关系[7]：

图1为牛奶凝结的典型频率响应曲线.其中曲线a是无菌的空白对照组，b、c为在灭菌奶中约加入含4.2×105cfu/mL嗜热链球菌后的典型频移曲线.开始由于细菌刚接种到牛奶中，处于适应期，所以代谢十分缓慢，频率基本不发生变化.一段时间后，细菌进入指数生长期，细菌大量繁殖，在细菌作用下，牛奶发酵产酸而凝结，此时频率开始急剧下降，直线1、2所对应的为约含4.2×105cfu/mL嗜热链球菌的牛奶在37℃和21℃时的频率检测时间（FDT）.空白组由于没有细菌加入，所需凝结时间较长，在21℃时10小时仍未观察到凝结现象；而当有约4.2×105cfu/mL细菌存在时，37℃时牛奶的凝结时间仅为1.5小时左右（见曲线c），而21℃时约需6小时才开始凝结（见曲线b）.由此可见，培养条件不同，FDT也不同.只有在培养条件相同、传代速度稳定时，细菌初始数目越大FDT值才越小，因此相同条件下可以通过测定频率发生变化的时间来间接测定细菌的初始数目.

图1 牛奶凝结的典型曲线

2.2 实验条件的选择

压电传感器用于生物反应液相检测过程受到多种因素的影响，常见的影响因素如溶液的离子浓度、粘度、密度、pH值、体积、温度等[14].故本文实验选取对细菌生长及活性影响较大的pH值和温度进行探讨.

露置牛奶在空气中一定的时间以使细菌滋生，在9 ml的灭菌牛奶中加入1 ml上述处理的牛奶，在不同温度下考察其频率响应曲线，结果见图2.由图2可以看出，温度对细菌的活性影响较大，曲线a、b、c、d分别为30℃、37℃、42℃和45℃时细菌的生长频率曲线.随着温度的升高，FDT逐渐减小.造成这一结果可能的原因是随着温度的升高，细菌增殖速度较快，大量产酸，使牛奶迅速凝结，介质的流变性、粘密度发生变化.另外温度的变化对测定介质-牛奶的理化特性也有一定的影响.但温度太高仪器不太稳定，故实验选取42℃作为检测温度.

检测介质的初始pH值对检测时间FDT也有较大的影响.在9 ml灭菌牛奶中加入1 ml含菌牛奶，用柠檬酸和柠檬酸钠固体调节pH值，图3为不同pH值下相同浓度细菌的频移曲线，从图3可以看出，pH值对实验结果有较大的影响. 曲线c（pH＝7.4）、d（pH＝8）斜率较曲线a（pH＝5.6）、b（pH＝6.8）大，说明介质的pH值越大，频率下降越快，且最大频移也较大.而pH值为6.8时的FDT最小（较pH＝5.6时的FDT缩短了约140分钟），说明此时牛奶中的主要细菌生长较旺盛.实验选取了FDT较短时的pH值为6.8的介质为实验介质.

图2 不同温度下细菌的频移曲线

图3 不同pH下相同浓度的细菌的频移曲线

实验还考察了无机盐对检测时间的影响，结果发现本实验中无机盐用量对测定结果无显著影响.

2.3 细菌含量的测定

图4为在选定的实验条件下，采用方法1.3对接种了不同浓度细菌后的试样进行测定所得到的频率变化曲线，从图4可以看出，加入细菌量越多，牛奶凝结所需的时间越短，即FDT越小.实验测试了一系列含不同浓度细菌的鲜乳，得到了校准曲线的线性方程为：

FDT（min）=662.36-94.75lgc（cfu/mL），R=-0.9963

上式中的C是检测液中细菌的初始浓度，FDT是频率检出时间，相关系数为0.9963，在细菌浓度为5.5×102-1×106cfu/mL范围内，FDT和细菌浓度的对数成良好的线性关系.根据上述公式，就可以由实验得到的FDT值计算出被检样品的细菌含量.

实验中所使用的细菌储备液的浓度由平板计数法获得，系列浓度的菌液由储备液用灭菌乳稀释一定倍数而成.

图4 不同浓度细菌的频率响应曲线

2.4 本文方法与平板计数法的比较

取5份牛奶样品（市售），分别用压电传感器和平板计数法同时进行测定.先用平板计数法对5份样品进行检测.然后使用本文方法对每个奶样平行测定5次，取其平均值与平板计数法的结果进行比较，结果见表1.

表1 本文方法与平板计数法测定结果（n=5）

从表1数据可以看出，用两种方法测定5个样品的最大相对偏差为6.94%；同时也可计算出t=2.1207，当自由度v=n-1=4，由 v=4查 t值表得 t值：t0.05（4）=2.776，t0.01（4）=4.604，今 t＜t0.05，故两种方法差异不显著，说明本文方法用于牛奶中细菌总数的测定是可行的.

3 结 论

本文应用压电传感器测定了牛奶中总菌数，样品不需要预处理，操作方便、灵敏、检出限低，并与传统的平板计数法所得实验数据无显著差异.但本方法由于检出时间的读取存在误差，且不同类型的细菌其响应特征有所不同，因此，对混合细菌的测定可能存在一定的误差，但本方法作为牛奶初步筛选的方法，可大大缩短检测时间，在微生物的快速检测中具有优势.

[1]ABDULLAH D A，SABRY A H.Bacterial quality of raw milk investigated by Escherichia coli and isolates analysis for specific virulence-gene markers[J].Food Control，2009，20:913-917.

[2]JOHNSON E A，NELSON J H，JOHNSON M.Microbiological safety of cheese made from heat-treated milk.Part I.Executive summary，introduction and history[J].J Food Prot，1990，53:441-452.

[3]HAYES M C，RALYEA R D，MURPHY S C，et al.Identification and characterization of elevated microbial counts in bulk tank raw milk[J].J Dairy Sci，2001，84:292-298.

[4]GRUETZMACHER T J，BRADLEY R L.Identification and control of processing variables that affect the quality and safety of fluid milk[J].J Food Prot，1999，62:625-631.

[5]HALL R H.Biosensor technologies for detecting microbiological foodborne hazards[J].Microbes Infect，2002，4（4）:425-432.

[6]PATEL P D.Overview of affinity biosensors in food analysis[J].J AOAC Int，2006，89:805-818.

[7]姚守拙.压电化学与生物传感[M].长沙：湖南师范大学出版社，1997:268-271，402.

[8]SHEN D Z，ZHU W H，NIE L H，et al.Behavior of a series piezoelectric sensor in electrolyte solution:Part I.Theory[J].Anal Chim Acta，1993，276（1）:87-97.

[9]DENG L，YAO S Z.On-line rapid detection of urease producing bacteria with a novel bulk acoustic wave ammonia sensor[J].Enzy Microbio Tech，1997，21（4）:258-264.

[10]ZHAO J W，ZHU W J，HE F J.Rapidly determining E.coli and Paeruginosa by an eight channels bulk acoustic wave impedance physical biosensor[J].Sensors&Actuators B，2005，107:271-276.

[11]刘素芹，戴高鹏，王启会.快速检测牛奶中大肠杆菌的压电生物传感器研究[J].食品科学，2009，30（4）:207-209.

[12]袁河清，李萍，刘有胜.压电体声波生物传感器检测食品中的结核杆菌[J].食品科学，2009，30（2）:201-203.

[13]刘素芹，戴高鹏，王启会.串联电极阵列压电传感技术自动检测病原体[J].传感器与微系统，2009，28（4）:66-68.

[14]张波，府伟灵，蒋天伦，等.压电石英晶体传感器液相检测的影响因素[J].第三军医大学学报，2002，24（1）:8-11.