黄芪皂甙和丹参酮ⅡA注射液对大鼠骨骼肌钝挫伤后氧化应激的影响

王茂林 陈世益 李云霞 陈疾忤 李宏云

1 南京医科大学附属明基医院骨科（南京 210019） 2 复旦大学附属华山医院运动医学科

骨骼肌损伤是运动医学领域常见的创伤，在损伤早期由于肌纤维的破坏，炎性细胞浸润导致大量氧自由基生成，从而加重骨骼肌损伤［1］。我们先前的研究证实了中药黄芪丹参复方注射液具有清除氧自由基，减轻氧化应激损伤的作用［2］，但复合物成分较为复杂，在促进骨骼肌损伤愈合过程中的具体成分仍不清楚。丹参酮ⅡA是丹参的脂溶性有效单体，具有清除氧自由基、改善微循环、保护血管内皮细胞的作用［3］。黄芪皂甙是黄芪中一类重要的有效成分，具有抗自由基损伤及抗脂质过氧化作用，对缺血再灌注的心肌和肾脏细胞均有保护作用［4］。本研究通过观察黄芪皂甙和丹参酮ⅡA注射液对骨骼肌钝挫伤后早期氧化应激的影响，探讨黄芪皂甙和丹参酮ⅡA是否是黄芪丹参注射液影响骨骼肌钝挫伤后氧化应激的主要有效成分，从而为其进一步的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组

雄性SD大鼠120只，体重200～220g，购自中国科学院上海实验动物中心，许可证号：SCXK（沪）2007-0005。国家标准啮齿类动物饲料饲养，自由摄食饮水，动物房温度21～23℃，相对湿度40%～60%。随机分为：黄芪皂甙组、丹参酮ⅡA注射液组、黄芪皂甙+丹参酮ⅡA注射液组、黄芪丹参注射液组、生理盐水对照组，每组24只；依据不同的观察时间点，每大组再分为4小组（损伤后第1、4、7、14天组，每小组6只大鼠）。

1.2 骨骼肌钝挫伤模型的制作

动物用2.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（0.2 ml/100g体重）后，参照Kami等［5］的方法，将大鼠后肢置于伸膝、踝背屈90°位，用重约335 g的重物自80 cm高处垂直打击大鼠右侧腓肠肌中段（打击面积为1 cm²，动能为2.63 J），制作骨骼肌急性钝挫伤模型。解剖证实骨骼肌钝挫伤成功率达100%。

1.3 药物干预

骨骼肌钝挫伤后即刻，分别于损伤部位进行肌膜外注射黄芪皂甙、丹参酮ⅡA注射液、黄芪皂甙+丹参酮ⅡA注射液（黄芪皂甙与丹参酮ⅡA注射液各0.5 ml混合，购于上海第一生化有限公司）、黄芪丹参注射液 （丹参注射液与黄芪注射液各0.5 ml混合，购于杭州正大青春宝制药公司）或生理盐水，注射剂量均为1 ml/只/次，以后每隔3天注射1次，直至取材。

1.4 实验取材

分别于损伤后1、4、7、14天随机取材，6只/次/组。动物用2.5%戊巴比妥钠麻醉后，迅速取出损伤的腓肠肌，冰预冷生理盐水冲洗、滤纸吸干，置液氮中保存。测试前，取出肌肉标本，冰上解冻后，制备10%（w/v）的匀浆，4℃、3500 r/min离心20 min，取上清，－20 ℃保存。

1.5 测试指标与方法

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量测定采用硫代巴比妥酸法；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性测定采用黄嘌呤氧化酶法；谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-px）活性测定采用谷胱甘肽氧化法；组织蛋白质浓度采用考马斯亮兰法检测。

上述指标均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒以及美国贝克曼（BECKMAN）公司生产的DU800紫外分光光度计测定，具体方法参照试剂盒说明书进行操作。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠腓肠肌钝挫伤后组织MDA的变化

如表1所示，与生理盐水对照组相比，第1天各组MDA无明显差异（P > 0.05），第4天黄芪皂甙组、丹参酮ⅡA注射液组、黄芪皂甙+丹参酮ⅡA注射液组、黄芪丹参注射液组MDA含量明显降低（P < 0.05），但黄芪皂甙组下降幅度较小，与黄芪丹参注射液组相比，丹参酮ⅡA注射液组、黄芪皂甙+丹参酮ⅡA注射液组MDA含量在第4、7天时无显著差异（P > 0.05）。

表1 各组大鼠腓肠肌钝挫伤后组织MDA的变化（nmol/mg prot）（n=6）

2.2 大鼠腓肠肌钝挫伤后组织SOD、GSH-px活性的变化

表2显示：与生理盐水对照组相比，黄芪皂甙组、丹参酮ⅡA注射液组、黄芪皂甙+丹参酮ⅡA注射液组、黄芪丹参注射液组SOD活性在第4、7天明显升高（P < 0.05），第14天各组间无显著差异（P > 0.05）；但黄芪皂甙组SOD活性在第4、7天的升高幅度明显低于丹参酮ⅡA注射液组、黄芪皂甙+丹参酮ⅡA注射液组、黄芪丹参注射液组（P< 0.05），而丹参酮ⅡA注射液组、黄芪皂甙+丹参酮ⅡA注射液组、黄芪丹参注射液组之间SOD活性在各时间点无显著差异（P > 0.05）。

表2 各组大鼠腓肠肌钝挫伤后组织SOD的变化（U/mg prot）（ n=6）

如表3所示：与生理盐水对照组相比，黄芪皂甙组、丹参酮ⅡA注射液组、黄芪皂甙+丹参酮ⅡA注射液组、黄芪丹参注射液组GSH-px活性在第4、7天显著升高（P < 0.05），第14天各组间无显著差异（P > 0.05）；但黄芪皂甙组GSH-px活性升高幅度在第4天显著低于丹参酮ⅡA注射液组、黄芪皂甙+丹参酮ⅡA注射液组、黄芪丹参注射液组（P < 0.05），而第7天黄芪皂甙组GSH-px活性与丹参酮ⅡA注射液组、黄芪皂甙+丹参酮ⅡA注射液组、黄芪丹参注射液组相比无显著差异（P > 0.05）；丹参酮ⅡA注射液组、黄芪皂甙+丹参酮ⅡA注射液组、黄芪丹参注射液组之间GSH-px活性在各时间点均无显著差异（P > 0.05）。

3 讨论

MDA是脂质过氧化反应所生成的各种脂质过氧化物中最重要的一种，是衡量机体自由基代谢水平的敏感指标。机体在正常状态下，存在氧化与抗氧化的平衡体系，内源性抗氧化酶如SOD可清除氧自由基［6］，从而保护细胞免受损伤。当机体抗氧化体系能力减弱时，大量未及时清除的氧自由基可攻击生物膜中不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应，导致脂质过氧化物如MDA生成。SOD活性降低和MDA增加表明了氧自由基大量生成，亦间接地反映了细胞损伤的程度。GSH-px是羟自由基和单线态氧的清除剂，是体内的重要保护因子。因此我们选用MDA和SOD、GSH-px指标反映机体内脂质过氧化反应的变化。

表3 各组大鼠腓肠肌钝挫伤后组织GSH-px的变化（酶活力单位）（ n=6）

丹参酮ⅡA是“活血化瘀”中药丹参的脂溶性有效单体，具有抗缺血缺氧，改善微循环，抑制血小板粘附聚集功能和抗血栓形成的作用。近来大量文献表明，丹参酮ⅡA是一种新的有效的细胞内脂质过氧化产物与DNA相互作用的抑制剂。它对DNA的保护作用很可能通过消除脂类自由基而阻断脂质过氧化的链式反应，抑制DNA合成物的生成，从而减少了后者的细胞毒性［7］实现。上述研究表明丹参酮ⅡA有促进机体对氧自由基的代谢、降低自由基水平的作用。

本研究也发现，骨骼肌钝挫伤后丹参酮ⅡA注射液组、黄芪皂甙+丹参酮ⅡA注射液组、黄芪丹参注射液组MDA含量均降低，表明丹参酮ⅡA能显著清除氧自由基，减少MDA生成，其机制可能是丹参酮ⅡA抑制DNA生成；而黄芪皂甙组MDA含量明显高于丹参酮ⅡA注射液，表明黄芪皂甙清除氧自由基的能力明显弱于丹参酮ⅡA。同时丹参酮ⅡA还可能通过改变抗氧化反应防御体系的表达起到抗氧化作用。本研究中，丹参酮ⅡA组SOD活性、GSH-px活性明显高于黄芪皂甙组及生理盐水对照组，而黄芪皂甙组SOD活性、GSH-px活性与生理盐水对照组相比升高不显著，表明丹参酮ⅡA的抗氧化能力明显高于黄芪皂甙。我们先前的研究证实了中药黄芪丹参复方注射液具有清除氧自由基，减轻氧化应激损伤的作用［2］，而黄芪皂甙和丹参酮ⅡA是中药黄芪丹参复方注射液的主要成分。本研究表明丹参酮ⅡA抗氧化能力及清除氧自由基的能力明显高于黄芪皂甙，因此，丹参酮ⅡA是中药黄芪丹参复方注射液在抗氧化作用方面的主要有效成分。

4 总结

黄芪皂甙和丹参酮ⅡA都具有减轻骨骼肌钝挫伤后氧化应激损害的作用，但丹参酮ⅡA作用更为显著。

［1］Toumi H，Best TM. The inflammatory response：friend or enemy for muscle injury? Br J Sports Med，2003，37（4）：284-286.

［2］王茂林，陈世益，李云霞，等. 活血生肌类中药对大鼠急性骨骼肌钝挫伤后氧化应激的影响. 中国运动医学杂志，2009，28（3）：289-292.

［3］Han JY，Fan JY，Horie Y，et al. Ameliorating effects of compounds derived from Salvia miltiorrhiza root extract on microcirculatory disturbance andtarget organ injury by ischemia and reperfusion. Pharmacol Ther，2008，117（2）：280-295.

［4］王娜，朱科，岳华，等. 黄芪总皂甙对心肌细胞氧化损伤的保护作用研究. 河北中医药学报，2007，22（2）：8-9.

［5］Kami K，Masuhara M，Kashiba H，et al. Changes of vinculin and extracellular matrix components following blunt trauma to rat skeletal muscle. Med Sci Sports Exerc，1993，25（7）：832-840.

［6］Nikolaidis MG，Paschalis V，Giakas G，et al. Decreased blood oxidative stress after repeated muscledamaging exercise. Med Sci Sports Exerc，2007，39（7）：1080-1089.

［7］Cao EH，Liu XQ，Wang JJ，et al. Effect of natural antioxidant tanshinone II A on DNA damage by lipid peroxidation in liver cells. Free Radic Biol Med，1996，20（6）：801-806.