耐力训练对动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠主动脉NF-kB和MMP-9表达的影响

刘善云 何玉秀 张洪侠 冯红 王洪涛 王敏 徐新女 王金环

1 天津体育学院健康与运动科学系（天津 300381） 2 河北师范大学体育学院 3 天津市第一中心医院卫生部危重病急救医学重点实验室 4 天津中医药大学临床实训教学部

动脉粥样硬化（AS）不稳定斑块的破裂及随后的血栓形成是导致临床急性冠脉综合征（ACS）的病理基础，对其发生机制及干预措施的研究具有重要的临床意义。基质金属蛋白酶（MMPs）与AS斑块的稳定性密切相关，在AS病变发展过程中起着重要作用［1］，而核因子-B（NF-B）可调控MMPs等炎症因子的表达，在形成AS时，NF-B激活可上调MMP-9的表达，后者可促进血管基质降解和AS病变进展及斑块破裂［2，3］。因此，抑制NF-B活化可有效减少或延缓AS的形成与发展。已有研究表明，有氧运动可通过改善血脂及抗氧化能力等机制而有效干预AS的形成［4］，并对实验动物已经形成的AS起到减缓其病变进展的作用［5］。但运动是否通过影响主动脉NF-B活化而发挥其抗AS作用尚待深入探讨。本实验通过建立ApoE-/-小鼠AS模型，观察耐力训练对AS小鼠主动脉NF-B和MMP-9表达的影响，进一步阐明运动抗AS的作用与可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

8周龄雄性ApoE-/-小鼠36只，体重20～22克，购自北京大学医学部实验动物中心[合格证号：scxk（京）2006-2008]，二级条件饲养。将实验动物随机分为14周AS模型组（H组）、26周AS模型组（HH组）、14周造模+12周运动干预组（HE组），每组12只。均饲以高脂高胆固醇膳食（胆固醇0.15%，脂肪21%）［6］。另选取12只具有相同遗传背景的8周龄C57BL/6J小鼠作为26周对照组（N组），饲以标准动物饲料。各组动物均自由饮食、饮水。实验室环境温度22～24℃，相对湿度50%，光照时间12小时/天。

1.2 运动方案

HE组小鼠从第15周开始在动物活动跑台上进行耐力训练，依据Fernando等的研究［7］，采用递增运动强度和时间运动，由10 m/min、30 min/次渐增至13 m/min、60 min/次（运动强度约相当于75%最大摄氧量），5次/周，共12周。每周测量小鼠体重，观察其生长状况及对运动负荷的适应能力等。

1.3 取材及标本处理

14周后处死H组小鼠以观察AS模型是否成功建立，其余各组继续进行12周实验，至26周处死HH、HE、N组小鼠。取材前禁食12小时，HE组停止运动24小时，以消除最后一次运动的急性影响。采取腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，眼球摘除法取血。取血后迅速打开胸腔，暴露心脏和主动脉，采用常规方法进行灌注和冲洗后，取出全心脏（包括主动脉弓），分离主动脉并剔除血管外附着组织后，置于4%多聚甲醛中固定4小时以上。将心脏及主动脉近心端1～1.5 cm组织用OCT包埋后-20℃冰箱保存，以制备主动脉冰冻切片。

采用BLATER冰冻切片机（ATTENPON公司），参照Suzuki等的方法［8］，自小鼠心底部开始作横断面连续切片。从主动脉瓣尖出现起连续横切，在显微镜下选取切片（主动脉横断面出现3个主动脉瓣尖时起至瓣尖消失），切片厚7 µm。每隔10张取1张，分别用于主动脉病理观察和NF-B及MMP-9表达的测定。

1.4 主动脉病理及组织形态学观察

取各组小鼠主动脉冰冻切片，行HE染色，光镜下观察其组织形态学特征及病理变化。

1.5 主动脉NF-kB mRNA表达及NF-kBp65和MMP-9蛋白表达的测定

1.6 统计学分析

实验数据采用统计软件SPSS 11.5进行统计处理，结果以均值±标准差（± s）表示，组间差异比较采用单因素方差分析，显著性水平为P < 0.05和P < 0.01。

2 结果

2.1 各组小鼠主动脉形态学变化

图1显示，H组小鼠主动脉内膜明显增厚，可见由大量泡沫细胞形成的脂纹期病变和纤维斑块期病变。

如图2所示，与H组相比，HH组（34周龄）小鼠主动脉病变明显加重，动脉内膜斑块较厚，泡沫细胞及胆固醇结晶（针状空隙）较多，局部呈玻璃样变性，可见大量炎性细胞浸润、聚集，脂质核心较大，显示出易损斑块的特征。与HH组相比，HE组小鼠主动脉AS病变程度相对较轻，尚未见到明显的胆固醇结晶和易损斑块的特征。

2.2 各组小鼠主动脉NF-kB mRNA及NF-kBp65阳性细胞%

表1 各组小鼠主动脉NF-B表达

表1 各组小鼠主动脉NF-B表达

注：** P < 0.01：与N组比较；## P < 0.01：与HH组比较。

2.3 各组小鼠主动脉MMP-9阳性细胞%

图4和表2显示，与正常对照组比较，HH组MMP-9阳性颗粒明显增多，其阳性细胞百分比显著高于对照组（P < 0.01），而HE组显著低于HH组（P < 0.01），这提示AS小鼠主动脉MMP-9表达较高，而12周耐力训练能有效降低其表达量。

表2 各组小鼠主动脉MMP-9表达

3 讨论

本实验结果显示，22周龄ApoE-/-小鼠已发生典型AS病变。继续饲养12周至34周龄时ApoE-/-小鼠主动脉AS病变明显加重，AS斑块明显增厚，可见大量的胆固醇结晶和炎性细胞浸润，部分样本呈现出易损斑块的特征，其病理形态学观察结果与近期研究报道一致［5］。与AS模型组相比，运动组小鼠AS病变程度明显减轻，表明12周耐力训练虽未逆转ApoE-/-小鼠已形成的AS病变，但能有效延缓AS病变的进展，从而发挥抗AS作用。

临床资料显示：60～75%ACS由AS斑块破裂继发血栓引起，AS不稳定斑块是心脑血管疾病的高危因素。因此，如何稳定AS斑块成为目前心血管疾病防治研究的热点。研究证实，MMPs与AS斑块稳定性密切相关，其中MMP-9在细胞外基质降解过程中起着关键作用，在AS不稳定斑块，尤其易发生破裂的斑块肩部区域MMP-9表达增高是导致斑块不稳定并形成血栓的重要原因［2］。而适度抑制MMP-9活性可提高AS斑块稳定性，有助于减少斑块破裂的发生［11］。本研究结果显示，在已形成AS的34周龄ApoE-/-小鼠动脉组织及斑块中MMP-9阳性细胞率明显增加，表明AS发生与MMP-9表达增加有关。12周运动干预能使主动脉MMP-9表达显著降低，其AS病变程度也较模型组明显减轻，说明运动可能通过下调MMP-9表达而减缓AS病变进展，并对AS斑块稳定性起到有益作用。

4 总结

耐力训练降低ApoE-/-小鼠主动脉NF-Bp65及其mRNA表达，下调MMP-9表达，从而发挥抗AS作用，可能是运动防治AS的机制之一。

［1］Galis ZS，Khatri JJ. Matrix metalloproteinases in vascular remodeling and therosclerosis： the good，the bad，and the ugly. Circ Res，2002，90（8）：251-262.

［2］Ferroni P，Basili S，Martini F，et al. Serum metalloproteinase 9 levels in patients with coronary artery disease：a novel marker of in fl ammation. J Investing Med，2003，51（5）：295-300.

［3］Luttun A，Lutgens E，Manderveld A，et al. Loss of matrix metalloproteinase-9 or matrix metalloproteinase-12 protects apolipoprotein e-deficient mice against atherosclerotic media destruction but differentially affects plaque growth. Circulation，2004，109：1408-1414.

［4］Marianne Pynn，Katrin Schäfer，Stavros Konstan-tinides，et al. Exercise training reduces neointimal growth and stabilizes vascular lesions developing after injury in apolipoprotein E–de fi cient mice. Circulation，2004，109（3）：386-392.

［5］刘善云，何玉秀，张洪侠，等. 耐力训练对ApoE-/-小鼠AS形成及病理变化的干预作用研究.中国运动医学杂志，2011，30（1）：41- 47.

［6］Shah PK，Jan Nilsson，Kaul S，et a1. Effects of recombinant apolipoprotein a-I（Milano） on aortic atherosclerosis in apolipoprotein E-de fi cient mice. Circulation，1998，97（8）：780-785.

［7］Fernando P，Bonen A，Hoffman Goetz L. Predicting submaximal oxygen consumption during treadmill running in mice. Can J Physiol Pharmacol，1993，71（10）：854-857.

［8］Suzuki H. Kurihara Y. Takeya M. et a1. A Role for macrophage scavenger receptors in atherosclerosis and susceptihility to infection. Nature，1997，386（6622）：292-296.

［9］Hameed O，Chhieng DC，Adams AL，et al. Does using a higher cutoff for the percentage of positive cells improve the specificity of HER-2 immunohistochemical analysis in breast carcinoma? Am J Clin Pathol，2007，128（5）：825-829.

［10］许良中，杨文涛. 免疫组织化学反应结果的判定标准.中国癌症杂志，1996，6（4）：229-231.

［11］Johnson C，Galis ZS. Matrix metalloproteinase-2 and-9 differentially regulate smooth muscle cell migration and cell—mediated collagen organization. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24 ：54-60.

［12］史立宏，王守训，高尔. 核因子-B的活性与动脉粥样硬化启动. 中国病理生理杂志，2003，110（19）：1527-1531.

［13］Chase AJ，Bond M，Crook MF，et al. Role of nuclear factor kappa B activation in metallopmteinase-1，3，and-9 secretion by human maerophages in vitro and rabbit foam cells produced in vivo. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2002，22（8）：765-771.

［14］郑广娟，张文高，刘龙涛，等. 脉心康对载脂蛋白E基因敲除小鼠核因子-B和基质金属蛋白酶9表达的调控. 中国动脉硬化杂志，2006，14（5）：444-445.

［15］华先平，孔祥辉，杜令，等. 氯吡格雷对兔动脉粥样硬化基质金属蛋白酶-9及血管壁核因子-B表达的影响. 临床心血管病杂志，2007，23（6）：464-467.